9.1前言
人们越来越需要了解GPCRs及其相关信号蛋白在细胞内的空间组织方式。新的高分辨率成像技术应运而生。特别是共聚焦成像和相关方法，如荧光和生物发光共振能量转移技术和光漂白后的荧光恢复(FRAP)的运用，为GPCRs的分子组织提供了有用的信息。
最近，荧光相关光谱(FCS)被用于研究天然和配体占位GPCRs的膜迁移率。FCS基于小检测体积获得的荧光波动的统计分析，可以精确定位在细胞内。使用自相关统计分析这些波动产生关于分布系数和荧光种类浓度的定量信息。与其他成像技术一样，FCS可以应用于单个活细胞，以研究其原生膜环境中的GPCRs。探测的单光子计数特性也意味着FCS是一种高灵敏度的技术。因此，即使FCS不是一种真正的“单分子”技术(不像单粒子跟踪)，在测量期间检测体积内的平均受体数量通常在0.5-150之间。FCS的一个特别优势是它的定量性质，直接提供被测物种的停留时间(扩散系数)和粒子数(浓度)。此外，在相对较宽的时间范围内 (0.1ms ~300 ms)，波动允许同时检测非常快速移动的物体(如配体)以及受体。研究膜受体时，FCS直接结合于GPCRs从而可以监测细胞膜小 区域内受体的分布。FCS还特别适合使用荧光配体来监测激动剂和拮抗剂占据受体的分布。在这种情况下，单一的测量允许测定游离配体和结合配体在小面积膜上的浓度。一系列基于FC的方法已经被开发出来，但是由于简单的原因，我们将局限于描述使用连续波激光激发的单点FCS的使用。我们描述了一个简单的FCS系统校准所需的基本技术。我们提供了使用FCS获取标记GPCRs的分布系数的方案。
9.2方法和技术手段
9.2.1荧光相关光谱原理
上个世纪七十年代，科学家首次描述了FCS的基本原理。然而，直到近20年后，随着光学和光子计数技术的发展，这一技术才得以应用于活细胞。
目前大多数FCS设备依赖标准的共聚焦显微镜。激光通过高数值孔径物镜聚焦到衍射限制点。在连续波激光激发的情况下，放置在共焦像面上的针孔产生一个小的探测体积，其形状为高斯-洛伦兹。在限定的测量位置中，FCS检测范围固定。荧光物质在扩散过程中，受到激发并发射光子。这些是由放置在针孔后面的单光子计数检测器以时间相关的方式检测到的。在一段时间内，这会导致检测到的荧光强度出现随时间变化的波动。这种波动可能是由于物质在限定范围内的平移扩散、荧光强度的变化(如环境变化)或荧光团内的光物理反应导致的。通过自相关分析对这些波动进行统计分析，可以量化扩散时间和浓度。在自相关分析中，将给定时间点t的荧光强度荧光猝灭度I与平均强度I的偏差与稍后小时间(t +)的偏差进行比较。这些偏差的乘积被归一化为平均强度的平方。当对读数中所有t值和一系列的时间值执行此操作时，得到自相关函数G。对于具有三维布朗运动扩散的单一粒子，该函数描述了一个s形衰减函数。衰减的中点(横坐标上)表示在测量过程中检测体积内的物种平均停留时间的变化。因此，随着扩散速度的减慢，停留时间增加(即扩散系数越小)，曲线右移越多。同样，在测量过程中，横坐标上的截距与体积中平均粒子数1/N的倒数成正比。因此，物种越集中，粒子数越高，曲线的振幅越低。因此，在较低的浓度下，自相关曲线具有更大的振幅和更好的定义，FCS可以有一个大约0.1-400 nm的动态范围。通过自相关曲线对适当的扩散模型进行非线性拟合，确定了相应的方差、D和N的值。重要的是，不同停留时间荧光物质的自相关函数只是简单的相加。因此，如果快速移动(如配体)和缓慢移动(如配体占用受体)物体共存于检测容量内，则将观察到双相自相关函数。每个分量对曲线振幅的贡献可以计算出每个分量的粒子数。可以检测到1.6倍的扩散时间差异(这相当于分子量的6倍差异)。
9.2.2荧光相关光谱所需设备
9.2.3常规荧光相关校准
9.2.4测量GPCR在细胞膜上的扩散
9.2.4.1荧光标签的选择
FCS荧光团的选择可能很复杂，因为光物理事件(如三态和暗态的形成)和光漂白会显著影响自相关曲线。使用FCS直接测量GPCR扩散，主要使用荧光蛋白融合法。现在有各种各样的荧光蛋白可用，它们的激发/发射最大值涵盖紫外光波长到红光波长。由于细胞自身荧光通常在较短的波长更明显，红移蛋白可能是有效的。其他考虑因素包括量子产率、光漂白、环境敏感性(如pH依赖性)、尺寸、光物理性质(如闪烁)和二聚倾向。其他一些最近开发的标签策略可能更灵活。例如，SNAP-tag和基于四半胱氨酸的“荧光素基砷发夹粘结剂”标记系统提供了用不同波长的探针对单个融合构建进行外源标记的方法。
荧光标签的位置也需要考虑。有些GPCRs在c -末端做标记已被证明非常成功。然而，对于较大的标签，这种标记会在空间上干扰c末端与相互作用蛋白(如支架蛋白和细胞骨架)的相互作用。这对膜的扩散有显著的影响。另一方面，标记在细胞外N端的GPCRs的成功表达往往会导致细胞无法将蛋白传递到细胞表面。在N端标签的上游加入一个短信号序列，已经取得了一些成功。
9.2.4.2细胞培养及操作
在FCS实验中，维持细胞健康对自身荧光最小化至关重要，这依赖于细胞类型。例如，CHO和HEK的自身荧光水平相对较低，而原代细胞往往具有较高的荧光水平。一些类型的细胞也不太耐受玻璃作为支持物，这可能导致细胞应激和更高的自身荧光。细胞应该在不含酚红的培养基中生长，因为后者可以显著促进背景荧光。类似地，缓冲液应该由低荧光的HPLC级水制成。细胞应该在缓冲液中洗两到三次以减少尽可能多的颗粒物，还应该在所需的温度下平衡5- 10分钟。通常，在室温(22 -24C)下，FCS更容易测量，因为在这个温度下，细胞膜运动更少，而细胞膜运动可能会引入大量的误差。
9.2.4.3自发荧光
所有的细胞系统都表现出一定程度的自发荧光。例如，可以通过使用不含酚红的培养基、保持细胞健康和使用长波长的激发光谱标签等方法将这种影响降到最低。自体荧光水平应直接通过在不含荧光标记受体的母细胞中进行FCS测量来确定。在这种情况下，在膜上的体积定位是困难的，应该使用细胞质测量。这可以通过将在细胞液的x- y位置定位测量体积，然后在细胞液的z位置进行强度扫描来实现。理想情况下，这些测量应该使用与标记受体相同的读取时间和激光功率，并平均超过细胞数(10-20)。自动荧光计数率可达0.5-3kHz。如果这种自发荧光在读取过程中逐渐减少，那么在FCS读取之前将细胞暴露在激光下(称为预漂白剂)可以消除干扰。如果自动荧光信号是稳定的，且不相关，则可以作为背景校正处理。如果自发荧光信号自相关，但小于在受体存在下得到的10%，则通常可以等比例运算。
9.2.4.4 膜荧光相关光谱测量
为了在细胞膜上对标记的GPCR进行FCS测量，首先得选择合适的细胞。细胞可以用汞/氙弧灯的宽场照明或扫描共聚焦照明来显示。重要的是，最初的可视化周期要短，以尽量减少漂白。选用形态正常、膜荧光明显的细胞；这将有助于薄膜上检测体积的精确定位。任何过量的细胞内荧光都可能表明蛋白质折叠不良或细胞健康状况不佳(尽管可能会出现高尔基体/内质网荧光)。细胞的最佳“亮度”可以通过经验来确定。非常亮的细胞可能产生一个低振幅的自相关曲线，随后很难拟合。相反，暗的细胞会产生较低的信噪比，信号可能不能高于背景水平。随着时间的推移，可以设置相机曝光或放大器增益，使具有适当荧光水平的细胞易于识别。使用混合亮度的细胞群(例如瞬时转染)或稳定转染的混合细胞群在这方面提供了最大的灵活性。
选择了一个细胞格后，应该使用所选择的可视化方法将体积定位在x和y平面上。x -y中体积的位置可以通过漂白涂有R6G的玻片盖上的一个点来确定(例如在表面涂上100nm R6G的乙醇溶液并使液体蒸发)。如果检测体积位于透镜光轴附近，则可获得最佳结果。为了获得上膜和下膜峰的最佳定义，建议将体积定位在细胞核上方的x-y位置。为了防止漂白，z扫描应该在尽可能低的激光功率下进行。然后检测体积应直接定位在膜上峰。
现在可以开始测量。最佳的激光功率和测量时间应通过实验确定。通常情况下，在激光照射的最初5-15秒内，计数率会逐渐下降(漂白)。这可能是由不动的受体引起的，并不相关的背景信号的计数率增加了。这有两个后果。首先，增加的背景降低了信噪比；其次，计数率的下降导致自相关曲线在高值时出现较大偏差，导致曲线无法解释。这种背景可以通过“预漂白”周期去除，即在数据采集开始之前，将样品暴露在激光下。这个预漂白的最佳时期可以通过监测一系列的初始漂白测量。数据收集时间本身会根据受体的停留时间而变化，但通常在30-100秒的范围内。这些数据可以收集为两到五组(例如3×20秒)。这样做的好处是，任何包含大量聚合、过度漂白或膜移动的数据集都可以从分析中删除。但是，需要注意的是，对于自相关分析，2×20 s的数据不如单次采集40 s的数据具有统计学作用。对于统计上有效的样本，理想情况下，应该记录1000个荧光团通过该容量的转换(例如，10秒的数据收集为10ms)。
最佳的激光功率也应根据经验来选择。激光功率必须足够高，才能提供高于背景和自发荧光的良好信噪比。然而，过高的激光功率会导致全球光漂白和斑点漂白。当荧光粒子通过激发束时直接被漂白就会发生斑点漂白。这将导致人为缩短停留时间，因为颗粒被过早地从体积中有效地“移除”。因此，最初建议在不同的激光功率下进行一系列的测量。最佳功率是指在自相关曲线上没有左移的情况下提供最佳亮度值的功率。理想情况下，这样的一系列操作应该在许多单独的细胞上进行。
一旦得到了满意的自相关曲线，就可以通过非线性曲线拟合得到合适的参数(扩散时间等)。对于加了荧光标签的受体，很可能这些曲线将包括至少两个成分：代表某种分子内光物理的事件,如闪烁(τD ≈ 50 - 400 µs)和其他(τD ≈ 1 - 80 ms) 代表转化受体的扩散。第二种成分实际上可能包含不止一种，可以通过在曲线拟合过程中添加额外的扩散成分来描述。
9.2.5测定配体占位GPCR的扩散
使用荧光受体配体结合FCS提供了一个强大的方式来研究不同功能受体形式的扩散特征。此外，该方法可用于内源表达受体；如原代细胞和混合细胞群中。缺少所需的蛋白质标记也意味着没有改变受体与信号酶或支架蛋白结合的风险。
但是，这种方法也有局限性。首先，需要设计、合成和表征合适的荧光配体。其次，FCS通常在低浓度下效果最好，实验通常在受体占用率低的情况下进行，在这种情况下，药理上对活性受体(激动剂)或非活性受体(反向激动剂)具有强烈偏好的配体将主要标记这些构象。此外，由于FCS是一种活细胞技术，三磷酸鸟苷的细胞内浓度高，与G蛋白结合的受体构象因此在这些条件下寿命很短。因此，需要根据这些药理学的限制来解释数据。
9.2.5.1荧光配体的设计
大多数选择合适的荧光团标记配体的标准与选择荧光蛋白标记的标准相似。标签应该是明亮的(有高量子产率)，光稳定，环境不敏感和有合适的光物理性质。各种各样的小分子荧光团可用于这一目的，如BODIPY，AlexFluor和菁染料提供一系列的激发/发射波长。从细胞的光毒性和自发荧光的角度来看，红移染料提供了一个更合适的选择。一般来说，染料的蓝移越多，自发荧光和光物理的并发症就越可能出现，尤其是在紫外光波段，光毒性。
使用FCS研究配体-受体相互作用的大部分初始工作是使用胺反应荧光团标记的荧光标记肽配体进行的。在这种情况下，配体与荧光团的相对大小意味着对药效团没有显著影响。但仍需充分考虑标签的位置，确认所标记肽的药理活性。
A类GPCRs小分子配体的荧光标记是一个更复杂的过程，因为荧光团通常与药效团大小相似。结构-活性关系需要研究，以确定合适的标记位置。这可能需要重新合成或衍生配体，以结合例如胺或硫醇基团，以促进氟团的连接。可能还需要一个连接子来分离荧光团和药效团。这种连接子的长度和组成(如柔韧性和水溶性)可以显著改变标记配体随后的药理活性。这些参数需要针对每个受体上的每个配体家族进行优化。最后，应该全面研究标记配体的药理活性。亲和性、有效性和亚型选择性会因添加一个荧光团而受到很大影响，其效果会随着上述参数(荧光团结构、标记位置、连接子长度和组成)的不同而不同。例如，对于所有配体，使用高效液相色谱的高纯度(>99%)是必需的，因为污染物会影响自相关曲线。在FCS测量的浓度下，想要获得足够高的受体占据率，需要的离解常数为50nm或更少。
9.2.5.2对配体占位受体进行荧光相关光谱测量
首先，应确定自由配体在适当缓冲液中的扩散时间。然后可以在随后的曲线拟合中修复(以及结构参数S)。本质上，用FCS进行配体结合测量类似于第9.2.4.4节中描述的过程。细胞应以同样的方法培养和制备，并考虑同样的自荧光(9.2.4.3)。配体浓度和孵育时间的选择取决于配体和受体，但这通常是在获得高度特异性膜标记(即最小化任何细胞内配体)和最高的分子亮度值序列之间的折中。5-50nm配体/10-20分钟的孵育是一个合适的起始点。
同样，细胞可以通过宽场或共焦照明显示。或者，一个宽场白光图像可以用来“盲”选细胞。在使用非荧光竞争性配体的实验中，这是一种有用的方法，以避免对特别明亮或昏暗的细胞的偏向。如前所述，测量体积应定位在x-y位置，在z扫描中位于原子核上方提供最明确的峰值，应在尽可能低的激光强度下进行。在z中定位体积需要比标记受体测量更加小心。当上膜峰衰减到50%时，通常建议将体积放置在该点上。这导致膜停留在大约靠近底部三分之二的体积。但是，使用这种方法时要小心，因为膜测量容易受到膜运动的影响，而膜进一步形成了照明体积的中心，因此膜测量的结果被夸大了。在这种情况下，不需要自由配体的浓度，体积可以直接放在上膜峰。测量也可以在较低的膜上进行，尽管配体进入这一区域通常会受到限制，这取决于细胞附着的性质。散射或反射光和移动受限的配体的“未搅拌层”效应也会出现问题。如果配体与玻璃载体相互作用或粘在玻璃载体上，这就特别麻烦。
如第9.2.4.4节所述，在确定最佳激光功率、数据采集长度和预漂白周期的应用时，类似的考虑也适用。然而，在大多数情况下，荧光配体不像荧光蛋白那样容易出现全漂白问题。部分原因是它们的光物理性质，不过，如果在有自由配体的情况下进行读数，就会有大量可用的替代荧光团。然而，斑点漂白仍然是一个问题，需要研究扩散时间的功率依赖性。
自相关曲线应至少包含两个分量。
快分布组件与一个类似的扩散时间的自由配体在缓冲区应该出现在曲线的左 部 (τD ≈ 50 - 100 µs)。如果体积在z的位置正确，那么这应该构成大约三分之一的曲线振幅。其余三分之二的振幅将由较慢的扩散分量组成。它们代表特异性受体结合配体、非特异性结合配体和细胞内配体。要解释哪种成分由哪种类表示是很复杂的，但可以通过下面的实验来区分。首先，细胞质测量将确定细胞内配体的浓度及其扩散时间。第二，至少在转染受体系统中，同样的实验也应该在不表达相应受体的细胞中进行。在这些实验中需要注意的是z扫描中看到的峰确实代表细胞膜而不是细胞质。第三，置换或竞争实验可以使用特定于目标受体的非荧光配体进行。经典地，竞争配体的浓度高于平衡解离常数KD的500 - 1000倍就可以提供完全的代替。在FCS实验中，由于完全置换配体将无法将体积放置在膜上，因此应使用浓度为50-100倍KD的溶液。这既给特定结合显著的位移，又留下足够的信号，以定位准确的量。然而，需要指出的是，在低受体占据率的情况下，一个与标记配体具有不同功效的竞争者(例如，一个反激动剂取代了一个完整的激动剂)可能会在放射性低聚物和结合实验中显示出KD的降低。
9.2.6数据分析
可以利用非线性曲线拟合技术从自相关数据推导出扩散时间和粒子数。马夸特-莱文伯格非线性最小二乘拟合方法就是其中之一。制造商的软件中往往含有这些方法(如Zeiss的AIM软件)，其他更常用的图形/统计软件(如GraphPad Prism、Origin、Igor或MatLab)也有类似的功能。
应使用最适当的生物物理模型进行拟合。
实验数据的筛选是分析过程的重要组成部分。对于包含大量重复测量的数据，需要从后续分析中删除不良数据集。例如，当平均计数率通过全漂白下降超过初始值的10%时，扩散时间的拟合值将向更长的值倾斜。同样地，如果在读取过程中发现计数率有任何较大的偏差(大于平均值的两个标准偏差)(例如，由于有明亮的聚集物或薄膜移动)，则应放弃测量。
在薄膜测量数据拟合时，可能需要比较几种模型。来自标记的GPCRs的数据最初可以拟合到2D扩散模型(注意，2D方程不需要S值)。这通常需要一个前指数项来解释光物理，特别是荧光蛋白，以解释闪烁。初始装配应该采用单个部件。如果配合较差，则可以添加进一步的扩散成分。例如，对于GFP和黄色荧光蛋白，通常需要第二种成分来解释复杂的光物理事件。然后，拟合还应该返回每个组件的部分贡献。每个组分的粒子数可以通过将分数组分乘以从拟合得到的总粒子数来简单地计算出来。当简单的二维扩散似乎仍然不能很好地拟合时，可以采用异常扩散模型。这为扩散时间引入了一个介于0和1之间的指数因子，以解释限制移动。拟合优度可以通过使用平方和来评估。不同的拟合模型应该使用F检验进行比较，以确定哪种拟合在统计上更有效。此外，对拟合中的残差进行目视检查可以表明拟合模型是否良好——残差的大偏差是可以接受的，前提是它们是非系统的。
对于配体结合数据，自由配体扩散时间应使用单组分三维布朗扩散拟合初步确定。在后续的结合数据拟合中，应该固定这个扩散时间(即扩散时间)和S，以使可变参数的数量最小。一般来说，用于结合数据的模型除了一个前指数项外，还包含一个3D扩散项(对于自由配体)和一个或多个膜结合配体的2D扩散项(对于膜结合配体)。如上所述，每一种物质的浓度可以从它们的分数贡献和总粒子数中计算出来。自由配体的浓度可以从这条曲线计算，使用一半的检测体积计算浓度。更常见的是单独测量 2 µm 细胞膜可以直接计算自由配体浓度。
在采取了许多相同的测量值的情况下(即在细胞间扩散时间应该保持相同)，对扩散时间数据进行全局拟合可以显著提高分析的统计能力。全局拟合同时比较所有数据集，并返回一个最适合所有数据的全局拟合参数值。在许多商业软件包中都可以找到这样的全局匹配例程。
在存在自荧光或高背景下，自相关曲线可能偏移。这可以通过在拟合中使用一个简单的附加偏移值来解释。同样地，如果背景荧光是已知的(这也同样适用于自发荧光)，可以通过使用(1- IB/IT)2的校正值对其进行校正，其中IB是背景强度，它是总强度。对于配体结合，一个特别重要的考虑是自由配体和结合配体之间的量子产额的差异。这一点也适用于任何涉及大型(明亮)聚合的数据。当存在多个分量时，自相关曲线的振幅以相对亮度的平方向较亮的种类倾斜。这可能导致对非常亮的粒子数的高估，以及随后对低量子产额的粒子数的低估。
Troubleshooting
•如果不能从含荧光团溶液中获得良好的校准数据(一致的扩散时间，高阶值，3 < S < 7)，则表明系统校准存在问题。检查物镜上的校正圈、针孔调整和准直器位置。提前2小时开机，有助于系统组件的光学稳定性，保持空气温度波动在±2-3摄氏度内。激光稳定性可通过荧光团浓缩溶液(10-5 m)和监测输出进行测试;这将实现一个稳定的计数率。
•如果细胞测量值低，应首先检查系统。如果没有问题，那么这可能是高水平的自发荧光或散射的细胞结构的结果。确保细胞状态良好，使用无酚红细胞培养液，测量至少 4 –5 µm 上面盖玻片来减少反射提高激光功率可获得更高的信噪比，但不能导致漂白。如果可能的话，使用自荧光较低的细胞系，或考虑在测量前漂白自荧光。
•高不相关的背景信号也会导致信噪比的大幅下降，这可能是受体大部分不动的结果，可以使用FRAP进行检查，在这些情况下，FRAP可能是更合适的技术。另外，也可以考虑相关技术，如图像相关光谱或扫描FC，因为这些技术更擅长检测慢速移动的种群。
•漂白(全球漂白和斑点漂白)可能是一个重大问题，尤其是荧光蛋白。使用最小的激光功率，给出一个可行的模态值和缩短读取时间到最小必要的扩散时间研究。预漂白可能有助于去除固定感受器，它漂白更快。如果可行的话，使用多光子激发将有助于减少全白化(也将有助于解决自身荧光问题)。然而，斑点漂白通常不会受到影响。
•当获得很高的计数率时(例如，这可能是一个非常明亮的配体浓度较高的问题)，探测器的后脉冲可能发生。对于缓慢扩散的配体来说，这通常不是问题(效果在非常短的能量值下可见)，试着将激光功率降低到最小。如果问题继续存在，尝试交叉相关的信号跨两个相同的检测通道-后脉冲将不相关的两个不同的检测器。
•如果正在评估接触药物或治疗后的扩散时间差异，那么可能是这些差异太小，无法被FCS检测到。扩散时间的变化与质量差的立方根成正比，这意味着需要6倍的质量变化才能得到1.6倍的扩散时间差。这是使用自相关分析可以可靠地检测到的最小差值。在这些情况下，可以使用光子计数直方图分析对波动数据进行替代分析。这种分析仍然提供了粒子数，但直接计算了分子的亮度，而不是扩散时间。这是足够敏感的，例如，允许区分单体和二聚体受体种类。
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