Genes regulated by DNA methylation areinvolved in distinct phenotypes during melanoma progression and are prognosticfactors for patients
受DNA甲基化调控的基因在黑色素瘤进展过程中参与了不同的表型，是患者的预后因素
发表期刊：Mol Oncol
发表日期：2022 Jan 24
DOI: 10.1002/1878-0261.13185
一、背景
基因组调控区的表观遗传学变化参与了肿瘤发生，并能通过改变基因表达来推动癌症的发展和进展。人类癌症显示出全局性的DNA低甲基化，同时伴有特定的启动子DNA低甲基化，分别与肿瘤抑制基因的癌基因活化和基因沉默相关。启动子DNA甲基化与基因沉默有关，而基因体DNA甲基化是活跃转录基因的特征。癌症相关的DNA甲基化异常不仅是治疗目标，也是癌症患者早期检测、预后和风险分层的有效生物标志物。
表观遗传机制的改变是人类皮肤黑色素瘤的特征，这是一种高度侵袭性和转移性癌症。由于DNA甲基化在黑色素瘤的发生和发展中起着重要作用，一些DNA甲基化的生物标志物已经被确定，并显示出与患者的总生存期、耐药性以及药物敏感性有关。
二、材料与方法
1.数据来源
1）Melan-a及其衍生的细胞系4C、4C11-和4C11+
2）利兹黑色素瘤队列（登录号EGAS00001002922）包含了703个原发肿瘤（无药）的基因表达谱，并被用来评估DNA甲基化特征的预后价值
3）使用黑色素瘤探索者工具访问了公开可用的人类黑色素瘤数据集，包括癌症基因组图谱（TCGA SKCM）（基因表达和DNA甲基化）、瑞典队列（基因表达和DNA甲基化），以及Bogunovic队列（mRNA）
4）使用Oncomine访问来自GSE3189、GSE8401和GSE19234研究的黑色素瘤数据集
2.实验流程
1）细胞培养、RNA测序（RNA-seq）、定量实时PCR、表观遗传学抑制剂处理、siRNA 转染、体内肿瘤形成和转移试验
2）增强的还原代表亚硫酸氢盐测序（ERRBS）：确定每个细胞系的碱基对级DNA甲基化概况，特别关注CpG岛和海岸；r软件包methylkit对小鼠细胞系之间的差异性DNA甲基化分析进行了配对比较；如果一个基因区域内至少包含三个CpG，则确定该区域为差异甲基化
3）转录组和甲基组数据整合：在细胞系之间的成对比较中，如果出现差异甲基化的基因与基因表达的变化，则选择这些基因，(a) 基因表达和基因体DNA甲基化之间的正相关，或(b) 基因表达和启动子DNA甲基化之间的负相关
4）基因富集分析：KEGG和Gene Ontology
5）临床样本生存分析
三、实验结果
01 - 基因表达的改变在黑色素瘤进展过程中受到启动子或基因体DNA甲基化的不同调节
为了揭示DNA甲基化如何直接改变基因表达并驱动黑色素瘤的发展和进展，作者使用了一个小鼠模型，该模型是通过对自发的永生化黑色素a细胞施加持续压力而开发的。本研究的黑色素瘤模型由四个细胞系组成，这些细胞系显示了黑色素瘤的线性发展，从黑色素细胞到前恶性黑色素细胞到非转移性黑色素瘤细胞到转移性黑色素瘤细胞类型。
研究表明，基因表达与启动子DNA甲基化之间是负相关的，但基因表达与基因体DNA甲基化是正相关的。因此，作者分析了以前四个细胞系的RNA-seq（转录组）和ERRBS（甲基组）的数据，并整合这些数据，以解开基因不同区域的甲基化如何影响基因表达。方法是选择在每次比较表达中显示与基因体DNA甲基化改变正相关的基因，以及显示表达变化与启动子DNA甲基化负相关的基因（图1A，B）。作者确定了一些同时具有基因体和启动子甲基化差异与基因表达改变相关的基因；然而，它们中的大多数在细胞系之间的甲基化变化显示出<20%的差异。那些在两个区域都表现出甲基化，并且细胞系之间甲基化差异大于20%的基因没有被用于进一步分析。
作者首先比较了黑色素细胞（melan-a）和代表黑色素瘤进展阶段的细胞系（4C、4C11-和4C11+）的数据，观察到启动子DNA低甲基化上调的基因数量较多。在比较了黑色素瘤与4C、4C11-或4C11+细胞后（图1C），表明转化的黑色素瘤细胞显示广泛的启动子DNA低甲基化，与黑色素瘤和其他人类癌症类型的发现一致。不同的是，将黑色素瘤-a与4C、4C11-或4C11+比较后，只观察到基因体DNA低甲基化下调的基因数量有轻微变化，表明基因体甲基化的变化在最初的黑色素瘤进展期间不太普遍。当比较4C和4C11-细胞之间的基因调控时，发现有少量的基因在启动子或基因体甲基化方面有变化，很可能是由于它们的表型特征非常相似。当比较黑色素瘤进展的初始阶段（4C和4C11-）和晚期4C11+细胞时，观察到更明显的基因表达变化，这与基因体或启动子DNA甲基化异常有关（图1A,B）。与4C和4C11-相比，在4C11+细胞中观察到大量因启动子DNA低甲基化和基因体DNA低甲基化而下调的基因。启动子DNA低甲基化和基因体DNA低甲基化上调的基因数量也很明显。
作者还观察了每个细胞系之间的配对比较中与基因体或启动子DNA甲基化变化相关的上调或下调基因的百分比（图1C）。当比较黑色素a细胞和其他三种细胞类型时，所有上调基因中的56-63%和所有下调基因中的36-46%与DNA甲基化变化相关联。在比较4C11+细胞与4C和4C11-细胞时，发现与DNA甲基化变化相关的上调基因（49-53%）的比例略低于下调基因（55-58%）。有趣的是，基因体DNA甲基化变化对黑色素瘤从早期到晚期的进展的贡献，对于上调基因（43-50%）和下调基因（36-44%）都很明显。4C和4C11-细胞显示出很少的基因表达差异，其中大部分不是由于DNA甲基化的改变，这表明在从恶性前黑色素细胞（4C）到非转移性黑色素瘤细胞（4C11-）的进展过程中，其他机制可能负责基因调节的变化。
图1 基因体和启动子区域的DNA甲基化在黑色素瘤进展的不同阶段调节着基因的表达
02 - 小鼠黑色素瘤模型中DNA甲基化驱动黑色素细胞恶性转化、EMT和转移
为了确定黑色素瘤潜在的表观遗传驱动因素，作者在小鼠模型中对受启动子或基因体DNA甲基化调控的差异表达基因进行了无监督的层次性聚类。用差异表达水平的对折变化（logFC）来表示聚类数据的热图，显示了不同的基因表达谱的改变（图S1）。由于小鼠黑色素瘤模型以线性方式包含黑色素瘤进展的不同阶段，决定通过将数据分层为三个特征：恶性肿瘤、上皮-间质转化（EMT）和转移，来确定在黑色素瘤进展和转移过程中受启动子或基因体DNA甲基化调控的差异表达基因。Melan-a、4C、4C11-和4C11+的转录组分析强调了细胞系之间的这些变化，并显示了通过恶性转化、EMT和转移特征发现预后标志物的潜力。
图S1 受启动子或基因体DNA甲基化调节的差异表达基因的表达
图2 鉴定恶性肿瘤、EMT和转移特征中由DNA甲基化调控的上调和下调基因
在对4C、4C11-和4C11+数据进行维恩图分析后，与黑色素a细胞相比，恶性特征基因（n = 41）被确定为那些共同的基因（图2A）。同样，在呈现分化表型的细胞（黑色素-a和4C11+）和具有未分化/间质表型的细胞（4C和4C11-）之间确定了EMT标志基因（图2B）。最后，将转移特征定义为在恶性4C11+细胞中与黑色素a、4C和4C11-细胞相比表达不同的一组基因（图2C）。还确定了每个签名中由于启动子或基因体DNA甲基化而上调和下调的基因。
接下来，作者评估了每个签名中上调和下调的基因中特定生物过程和分子通路的代表性（图2）。恶性肿瘤特征中上调的基因富集于与突触过程和神经组织有关的途径（图2）。上调的EMT特征基因富集于参与调控细胞发育早期阶段的过程（图2E），表明这些基因对未分化的状态很重要。关于转移特征，上调的基因富集于神经分化过程（图2F）。没有观察到恶性肿瘤特征中下调基因的功能类别的富集，因为只有少量的基因被确定。存在于EMT特征中的下调基因富集于涉及细胞发育早期阶段的过程（图2J），而转移特征中的下调基因富集于对生长刺激因子的反应和ERK1和ERK2信号通路级联的正向调节（图2K），这是人类黑色素瘤中已知被破坏的通路。
图2 鉴定恶性肿瘤、EMT和转移特征中由DNA甲基化调控的上调和下调基因
03 - 在小鼠黑色素瘤模型中确定的基因签名与黑色素瘤患者的Breslow厚度、肿瘤免疫细胞评分和患者生存率相关
为了评估每个签名中受DNA甲基化调控的基因的潜在预后价值（图2），作者评估了来自利兹黑色素瘤队列的703个原发性黑色素瘤样本的基因表达值（当组织在2000-2012年期间取样时为药物无效的患者）。将构成每个签名的基因的基因表达水平平均为一个分数，并评估了高/低分样本与黑色素瘤特定患者生存率（MSS）（图3A）、Breslow厚度（黑色素瘤最重要的预后因素）和肿瘤免疫细胞评分的相关性（图3B）。EMT签名基因与较长的MSS明显相关，而存在于转移签名中的基因与较短的MSS相关（图3A）。这些发现也用Kaplan-Meier图来强调（图3C-E）。
与此观察一致，EMT表达特征与Breslow厚度呈负相关，与T细胞、B细胞和细胞毒性细胞计数（免疫细胞评分）呈正相关（图3B）。观察到转移特征的综合评分有相反的趋势，其中这些基因的表达与Breslow厚度呈正相关，与免疫细胞评分呈负相关。进一步联合分析了EMT和转移特征和免疫细胞评分对MSS的这些对立影响（图3F-H）。EMT签名高而转移签名基因表达分数低的患者生存期最长，反之亦然，反映了这两种签名之间的独立性（图3F）。EMT和转移特征的预后效果也独立于T细胞评分（图3G,H）。总的来说，这些结果表明，模型中发现的EMT和转移基因甲基化特征，可能是黑色素瘤患者的独立预后生物标志物。
图3 基因特征作为黑色素瘤患者的预后因素
04 - 小鼠黑色素瘤进展的表观遗传驱动基因的鉴定
作者接下来分析了每个签名以确定表观遗传驱动基因。每个签名中大多数有证据表明受表观遗传调控的上调基因在细胞系之间显示出不同的启动子DNA甲基化（恶性97%，EMT83%，转移签名88%），而只有少数基因受基因体DNA甲基化调控（恶性3%，EMT17%，转移签名12%）。相反，有表观遗传调控证据的下调基因是由不同的启动子（恶性肿瘤中40%，EMT中45%，转移特征中65%）或基因体（恶性肿瘤中60%，EMT中55%，转移特征中35%）DNA甲基化驱动，没有明显的偏差（图4A-C）。
为了寻找每个签名中受DNA甲基化调控的特定驱动基因，使用网络工具STRING分析了硅基蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）以选择可能在黑色素瘤进展和转移中发挥作用的重要表达枢纽。观察到恶性肿瘤特征蛋白之间的相互作用很弱（图4D）；然而，发现LRRK2是与特征蛋白中大多数蛋白的相互作用伙伴，是LRRK2本身因启动子DNA低甲基化而上调。作者观察到EMT特征中的蛋白质之间有很强的相互作用（图4E）。其中，确定了Inpp4b基因，该基因在EMT特征中被基因体DNA低甲基化下调，是一个潜在的表观遗传驱动器。转移特征的PPI显示了大量的蛋白质和相互作用（图4F）。其中，发现Adcy3是一个潜在的表观遗传调控基因，因为Adcy3在这个签名中被启动子DNA低甲基化所上调。
图4 Lrrk2、Inpp4b和Adcy3分别是恶性肿瘤、EMT和转移特征中重要的表观遗传调节枢纽
为了更好地了解Lrrk2、Inpp4b和Adcy3在小鼠黑色素瘤模型中的表观遗传调节，作者分析了ERBBS和表达数据的CpG决议甲基化水平（图5A-C）。Lrrk2在melan-a细胞中显示出基于启动子DNA甲基化的沉默，但在4C、4C11-和4C11+细胞中完全低甲基化并上调（图5A,D）。Inpp4b在黑色素a和4C11+细胞中呈现大量的基因体DNA甲基化，但在4C和4C11-细胞中没有。这些与4C和4C11-细胞中Inpp4b的表达量低于黑色素a和4C11+细胞相关（图5B，E）。最后，在黑色素a、4C和4C11-细胞中检测到启动子Adcy3的DNA甲基化，与基因沉默相关。然而，4C11+细胞通过启动子DNA低甲基化显示基因激活（图5C,F）。
作者接下来用DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5azaCdR和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A（TSA）处理每个细胞系，以确定启动子或基因体DNA甲基化如何驱动Lrrk2、Inpp4b和Adcy3的表达。Lrrk2在5azaCdR和/或TSA处理后在黑色素a细胞中上调（图5G），Inpp4b的表达在单独用5azaCdR处理4C和4C11-细胞后没有明显变化（图5H）；然而，Inpp4b在4C细胞用TSA（HDAC I/II类的特异性抑制剂）处理后重新激活，表明染色质修饰可能对调节该基因在恶性前期黑色素细胞的表达很重要。5azaCdR和TSA都没有大幅增加Inpp4b在4C11-细胞中的表达，表明其他机制可能调节该基因在非转移性黑色素瘤细胞中的表达。与其他细胞系相比，在4C11+细胞中观察到较低的Adcy3启动子DNA甲基化，而且正如预期的那样，4C11+细胞显示出较高的Adcy3基因表达（图5F）。最后，观察到在5azaCdR和TSA联合处理后，在melan-a、4C和4C11-细胞系中Adcy3基因的表达明显增加（图5I），这表明DNA去甲基化是Adcy3重新激活所必需的。
图5 Lrrk2、Inpp4b和Adcy3受表观遗传调节
05 - Adcy3和Inpp4b是黑色素瘤的潜在致癌物
作者接下来利用siRNA敲除技术确定Adcy3和Inpp4b在体内肿瘤生长和体内转移潜力的情况。选择4C11+细胞系进行分析，通过将Adcy3-或Inpp4b沉默的4C11+细胞皮下注射到小鼠侧翼区域来确定体内肿瘤生长。与对照组相比，注射Adcy3沉默的4C11+细胞（siAdcy3）的小鼠的肿瘤大小和重量都较小（图6A,B），表明该基因可能在肿瘤生长和发展中发挥重要作用。Inpp4b沉默的4C11+细胞（siInpp4b）与对照组细胞相比，在肿瘤大小和重量上没有任何明显差异（图6A,C）。
图6 Inpp4b和Adcy3分别促进体内转移的形成和肿瘤的生长
通过静脉注射Adcy3、Inpp4b沉默的4C11+细胞或对照细胞来评估小鼠肺部的转移形成。对于Adcy3沉默的细胞，没有观察到关于转移灶大小和细胞数量的任何差异；然而，注意到注射Inpp4b沉默的细胞的小鼠的转移灶大小明显减少，这表明Inpp4b在促进转移中的作用（图6A-C）。总之，这些结果首次显示了Adcy3在体内肿瘤生长中的潜在作用以及Inpp4b在肿瘤侵袭性和转移形成中的参与。
06 - Lrrk2、Adcy3和Inpp4b DNA甲基化水平对黑色素瘤患者有预后价值
作者分析了人类黑色素瘤队列中LRRK2、ADCY3和INPP4B的DNA甲基化和表达谱，以确定鼠类模型数据是否适用于人类黑色素瘤生物学。使用Melanoma Explorer网络工具，分析了TCGA、瑞典黑色素瘤队列（GSE51547）和Bogunovic队列（GSE19234）中公开的DNA甲基化、基因表达和患者结局数据。
根据TCGA的数据，LRRK2在基因体和启动子区域的DNA甲基化与患者的生存率并不相关；然而，在同一队列中，LRRK2的高表达与患者生存率的提高明显相关。INPP4B基因座内几个CpG位点的DNA低甲基化与不良的生存率明显相关（TCGA和瑞典队列）；然而，一个CpG位点的DNA低甲基化与不良的生存率相关（瑞典队列）（图7A）。大多数CpG位于内含子或内含子边界；这与小鼠数据相似，在其基因体区域发现了不同的Inpp4bDNA甲基化。
来自TCGA和Bogunovic队列的原发性黑色素瘤的基因表达数据显示，较高的INPP4B基因表达值与患者的不良生存率相关（图7B），强调了INPP4B DNA甲基化和基因表达在黑色素瘤患者中的预后重要性。
在GSE51547和TCGA队列中，位于ADCY3的11个CpG的DNA甲基化水平与不良的生存率明显相关，其中10个CpG显示DNA低甲基化，一个CpG显示DNA高甲基化（图7C）。来自HunterAustralians队列（GSE59455）的ADCY3基因表达增加也与生存率低有关（图7D）。这些发现与小鼠模型产生的结果一致，其中最具侵略性的细胞系表现出由启动子DNA低甲基化或基因体DNA低甲基化驱动的高基因表达。
图7 DNA甲基化作为黑色素瘤患者生存的预后标志物
四、结论
腺苷酸环化酶3型（Adcy3）和肌醇多磷酸4-磷酸酶II型（Inpp4b）被确定为受DNA甲基化调节的基因，分别影响黑色素瘤的生长和转移。重要的是，根据黑色素瘤进展的小鼠模型中的基因表达和DNA甲基化图谱发现的潜在预后标记，在大型原发性黑色素瘤患者群中得到了验证。
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