基因组生信分析教程
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今天介绍肿瘤微卫星不稳定性的计算方法（MSI），这个指标在肿瘤治疗前的指导作用非常重要，无论是靶向还是免疫治疗，都是必须进行检测，以帮助患者获得最佳的治疗效果，那么这个值该怎么来计算呢？下面就给大家介绍一下。
微卫星不稳定（MSI）是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的MS序列长度改变的现象，常由错配修复（MMR）功能缺陷引起。MSI现象于1993年被Jacobs等人在结直肠癌中首次发现，与癌症发生有关，可用于癌症检测。
由于微卫星数量庞大且遍布整个基因组，因此位于多个基因上的微卫星不稳定将会导致与肿瘤相关的多个信号通路中的多个基因功能异常，进而导致 MSI-H 肿瘤的发生发展。
什么是 MSI-H 肿瘤 ？
MSI-H 肿瘤是指一类具有微卫星高度不稳定（MSI-H）表型的肿瘤，发生于多个部位，最常见的发生部位为结直肠、子宫内膜、胃、小肠，同时也发生于其他部位。
中国MSI-H肿瘤疾病负荷每年高达近30万例，与每年新发乳腺癌病例数相当，且远远超过前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等。MSI-H肿瘤的分子病因导致其对免疫治疗敏感性强，同时 MSI-H肿瘤具有独特的临床/分子病理特征。
为什么会发生 MSI？
MSI 的发生与错配修复系统（MMR）功能异常密切相关。正常细胞中，MMR 系统蛋白能够识别和修复这些错误，该系统包括主要的4个蛋白 MLH1、MSH2、 MSH6 及 PMS2。而肿瘤细胞中，MMR 蛋白功能异常，无法修复 DNA 复制过程中发生的错误，最终造成 MSI 的现象。
在免疫组化 MMR 蛋白检测中，若 4 个 MMR 蛋白均表达，则为 pMMR，相当于 MSI-L/MSS 型，若任一蛋白缺失，则为 dMMR 型，相当于 MSI-H 型。
微卫星不稳定性与错配修复缺陷
微卫星（microsatellite）又称简单重复序列，是存在于基因组中的一些小片段核苷酸的重复序列，重复单位一般由1~6个核苷酸组成，15-65个这些序列在基因组上重复分布就构成了一段微卫星微卫星序列（如下图所示）。人类基因组约存在55000~100000组微卫星序列，它们广泛分布在基因组的各个角落，但在染色质末端的部分出现频率较高。微卫星的存在具有广泛性，原核、真核细胞的基因组中都有微卫星的存在。目前研究已经鉴定并确认至少2000个以上的人类基因组多态性微卫星标记，其中很大一部分已经被应用于遗传连锁研究。
微卫星序列具有高度保守性和稳定遗传性，属非转录和组成型基因，根据以上特点可将微卫星归结为一类呈高度多态的遗传标志，应用于个体鉴定、人类基因分析等方面。实验研究证明这些序列可以影响某些细胞基因的表达，对基因组起着直接或间接的调节作用，它们定位、连接于多个重要的基因位置，这些位置不仅与人类疾病相关的标记，而且直接与病因学相关。
微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），即由于复制错误导致微卫星区域出现碱基对的插入或丢失的现象，MSI最先在结直肠癌中被发现并被认为是遗传性非息肉病性结直肠癌 （hereditary non－polyposis colorectal cancer，HNPCC，又称Lynch综合征）的特征，此后又发现于多种散发性肿瘤中（如胃癌、肺癌、子宫内膜癌）。
目前认为微卫星不稳定性的原因主要有以下三种：
1点突变
点突变造成MSI的机制很好理解。某些肿瘤由于DNA损伤修复功能遭到破坏，基因组不稳定性增加，反应在微卫星序列上的结果就是MSI。
2 滑链错配（slipped-strand mispairing）
一般认为DNA复制过程中的滑链错配（slipped-strand mispairing）是导致重复序列多态性的主要机制。复制滑动是在DNA合成过程中，一条单链DNA可以发生一过性脱位，生成一个中间性的结构后，再与另一条DNA单链错配，形成链滑动，继续DNA的复制或修复。滑动错配可以造成缺失、插入或碱基替换：
3 错配修复缺陷（MMR deficient，dMMR）
微卫星序列是DNA复制过程中最容易发生错配的序列，需要错配修复（mismatch repair，MMR）相关蛋白进行修复。MMR是一种高度保守的细胞过程，在DNA复制过程中起着重要的作用。MMR主要负责在DNA复制后对碱基进行修复，另外也可以修复一些小的核苷酸插入或缺失。执行MMR功能的关键基因包括MutL同源物1（Mult homolog 1，MLH1）、MutS同源物2 （Mult homolog 2，MSH2）、MSH6和减数分裂后分离增加2（postmeiotic segregation increased 2，PMS2）等。MMR蛋白在DNA复制、遗传物质重组和化学或物理损伤过程中以异二聚体复合物的形式存在，这些复合物包括MutSα（MSH2蛋白与MSH6蛋白组合）、MutLβ （MLH1蛋白与PMS1蛋白组合）、MutSβ（MSH2蛋白与MSH3蛋白组合）和MutLα （MLH1蛋白与PMS2蛋白组合）。在DNA复制发生错配后，首先MutSα识别并结合DNA链，招募MutLα，经构象改变后，从错误位点释放，随后招募核酸外切酶-1切除错配区域，复制因子A稳定单链DNA，由DNA聚合酶Polδ和增殖细胞核抗原形成的复合物填补空缺，最后由DNA连接酶修复缺口。有研究证实，MMR使DNA复制的准确性提高了100～1000倍。若MMR基因或蛋白功能缺陷，DNA复制错误得不到修正，错误的逐渐积累加剧基因的变异，进而产生dMMR表型。
根据MSI水平的高低，可将MSI分为三种类型：低微卫星不稳定（low microsatellite instability，MSI-L）、高微卫星不稳定（high microsatellite instability，MSI-H）以及微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）dMMR是高水平微卫星不稳定的必要条件，在临床实践中，基本可以将dMMR等同于MSI-H。
MSI 检测的 4 大临床意义
辅助诊断林奇综合征
林奇综合征曾被称作遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)，这是一种常染色体显性遗传肿瘤综合征，患者罹患结直肠癌或其他多个部位（包括子宫内膜、卵巢、胃、小肠、肝胆、上尿道、脑和皮肤等）的恶性肿瘤风险显著升高。
林奇综合征约占所有结直肠癌患者的2%-4%，是最常见的遗传性结直肠癌综合征。
林奇综合征的主要致病因素是MMR基因（MLH1、 MSH2、MSH6 或 PMS2 基因）的致病性胚系突变或 EPCAM 基因缺失导致 MSH2 基因沉默。因此，MMR/MSI的检测可以作为林奇综合征的初筛手段。
对于经初筛确定的dMMR/MSI-H的患者，再考虑林奇综合征相关基因的胚系突变检测，以明确诊断。
判断预后
结直肠癌
2000 年，在一项使用2B3D NCI Panel诊断方法对607 例结直肠癌患者进行预后分析中，发现I~IV期的MSI-H结直肠癌患者比MSS结直肠癌患者均有显著的生存优势 (HR = 0.42, 95%CI：0.27-0.67, P<0.001)，且 MSI-H 患者具有较低的区域淋巴结转移率 (HR = 0.33, 95%CI：0.21-0.53，P<0.001) 和远处器官转移率（HR = 0.49，95%CI：0.27-0.89，P<0.02），该研究首次提示MSI-H是结直肠癌的独立预后判断指标。
一项纳入32个研究共7642例患者的Meta分析显示，相较于 MSS，MSI-H是预后良好的独立预测指标，HR = 0.65（95%CI：0.5-0.71）。因此，dMMR/MSI-H表型的结直肠癌虽然往往分化较差，但通常预后较好，目前公认dMMR/MSI-H是II期结直肠癌独立良好预后因子。
在II期结直肠癌患者中，高危因素包括T4、组织学分化差 (3/4 级，不包括MSI-H者)、脉管浸润、神经浸润、 术前肠梗阻或肿瘤部位穿孔、切缘阳性或情况不明、切缘安全距离不足、送检淋巴结不足12枚，而dMMR/MSI-H被认为是低危因素。
胃癌
近期，一些研究表示，具有MSI-H表型的胃癌患者预后较好，也无法从辅助化疗中获益。在一项Meta分析中显示，MSI-H的胃癌患者预后较好，且淋巴结转移少，肿瘤浸润浅，（HR = 0.63，95%CI：0.52-0.77）。
基于此，《胃癌 CSCO 诊疗指南》（2019 版）中推荐 MSI/MMR 检测用于判断预后。
预测辅助化疗疗效
结直肠癌
在一项回顾性研究中长期随访了II/III期结直肠癌，并首次提出MSI可能是辅助化疗的疗效预测指标，且MSI-H结直肠癌不能从5-FU化疗中获益。
在另外一项研究中也得出了相似的结论，dMMR/MSI-H结直肠癌患者不能从5-FU辅助化疗中获益，尤其在II期结直肠癌中，反而生存期缩短（HR = 2.3, 95%CI:0.84-6.24）。这些研究数据表明，II期的dMMR/MSI-H型的结直肠癌患者不仅无法从5-FU单药辅助化疗中得到生存获益，反而是不利的。
目前，国外的NCCN指南和国内的CSCO指南均指出，II期的dMMR/MSI-H型的结直肠癌患者预后较好，不建议使用氟尿嘧啶类单药辅助治疗。
胃癌
在胃癌中，MSI-H也能够预测辅助化疗疗效。MAGIC研究结果显示，仅接受手术治疗的患者中，dMMR/MSI-H患者的OS未达到，而pMMR/MSI-L/MSS患者的OS为20.5 个月（P值=0.09），接受手术和化疗的患者中，dMMR/MSI-H患者的OS为9.6个月，pMMR/MSI-L/MSS患者的OS为19.5个月（P 值 = 0.03）。
综上，dMMR/MSI-H给仅手术治疗的患者带来阳性预测结果，而接受化疗的患者与阴性预测作用相关，因此，可手术的 dMMR/MSI-H患者不能从围手术期化疗中获益。
指导免疫治疗疗效
2015 年，某研究首次报道了dMMR/MSI-H型的结直肠癌患者能够从帕博利珠单抗的治疗中获益，同时，发现dMMR/MSI-H型的其他癌种患者也能够从中获益。后续在更大样本量的研究中，帕博利珠单抗在12个癌种的dMMR/MSI-H患者中的疗效得到再次证实。
这些研究表明，dMMR/MSI-H患者能够从免疫检查点抑制剂中获益，且不限癌种。
基于此，美国FDA 于2017年批准了帕博利珠单抗用于治疗dMMR/MSI-H 型不可切除或转移性经治的实体瘤患者。紧接着，FDA 批准纳武利尤单抗单药或联合伊匹木单抗用于氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后出现进展的 dMMR或MSI-H的转移性结直肠癌患者。
由此，MSI 成为了所有实体瘤中免疫治疗疗效的预测因子，可见 MSI 的检测将在整个肿瘤领域越来越重要。
哪些患者应检测 MSI？
所有确诊的结直肠癌患者；子宫内膜癌患者；胃癌患者；小肠腺癌患者；Lynch 综合征筛查的肿瘤患者；免疫治疗的所有实体瘤患者。
对免疫疗法指导性意义
MSI—H：高，对免疫疗法更加敏感，更能从免疫治疗药物获益；
MSI—L：低，对免疫疗法不敏感，不太可能获益；
MSS：稳定，对免疫疗法不敏感， 不太可能获益。
目前研究发现，这项指标似乎更适用于消化道恶性肿瘤对PD-1抗体疗效的评估。
肿瘤MSI的计算原理和数学模型
MSI是微卫星不稳定性(microsatellite instability)的缩写，MSI是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。
一般来说，微卫星不稳定分为三类：分别是微卫星稳定（MSS）、微卫星低不稳定（MSI-L）、微卫星高不稳定（MSI-H）。MSI检测可以评估免疫治疗的在癌细胞治疗中的效益。
一般的，当有两个marker不稳定（小panel）或者30%以上的marker不稳定时（大panel），就是MSI-H；当有一个marker不稳定（小panel）或者30%以下的marker不稳定时（大panel），就是MSI-L；当没有marker不稳定时，就是MSS。
TCGA 数据库分析肿瘤 MSI score
实例操作
软件包安装
if (!require("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("cBioPortalData")
BiocManager::install("AnVIL",force = TRUE)
install.packages("rapiclient")数据读取
主要是下载cBioPortal的临床信息，有很多是其他渠道找不到的。
使用起来非常简单：
library(cBioPortalData)
library(rapiclient)
library(AnVIL)
cbio <- cBioPortal()
studies = getStudies(cbio)
head(studies$studyId)
## [1] "acc_tcga" "all_stjude_2015" "all_stjude_2013" "acbc_mskcc_2015"
## [5] "acyc_fmi_2014" "acyc_jhu_2016"
id = "ucec_tcga_pan_can_atlas_2018"这是临床信息的数据列名，里面就包括了MSI_SCORE_MANTIS这一列:
clinical = clinicalData(api = cbio, studyId = id)
df = na.omit(clinical[, c("patientId", "MSI_SCORE_MANTIS")])
colnames(df)[2] = "MSI_score"
df$MSI_score = as.numeric(df$MSI_score)
k = df$MSI_score > 0.4
table(k)
## k
## FALSE TRUE
## 358 168
df$Group = ifelse(k, "MSI", "MSS")
head(df)
## # A tibble: 6 × 3
## patientId MSI_score Group
## <chr> <dbl> <chr>
## 1 TCGA-2E-A9G8 0.323 MSS
## 2 TCGA-4E-A92E 0.340 MSS
## 3 TCGA-5B-A90C 0.334 MSS
## 4 TCGA-5S-A9Q8 0.320 MSS
## 5 TCGA-A5-A0G1 0.311 MSS
## 6 TCGA-A5-A0G2 0.400 MSI绘制MSI分布图
R语言的好处就是拿到了数据可以进行自定义的可视化，比网页工具更加灵活，也更好重复。整理好了数据，就可以画图啦
library(ggplot2)
ggplot(df, aes(x = Group, y = MSI_score, fill = Group)) + geom_boxplot() + geom_jitter(size = 0.5) +
geom_hline(yintercept = 0.4, lty = 4) + theme_bw()
References:
-
Dudley, J.C., et al., Microsatellite Instability as a Biomarker for PD-1 Blockade. Clin Cancer Res, 2016. 22(4): p. 813-20.
-
2. Chen, W., et al., Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin, 2016. 66(2): p. 115-32.
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