最近，通过鉴定解读蛋白ALYREF和YBX1，人们对m5C在编码转录本中的潜在功能有了进一步的机制认识。这些蛋白已被证明分别与mRNAs中的m5C位点结合以调节核细胞质运输和mRNA的稳定性
(Chen et al., 2019; Yang et al., 2017).
虽然很明显，m5C可以在多种分子环境中发挥不同的作用，但仍不清楚m5C的甲基体如何作为一个整体来维持发育。
这篇文章生产了第一个没有检测到这种修饰水平的动物菌株，并使用这种遗传工具确定了m5C位点的定位及其对生理和压力的影响
未发现NSUN3、NSUN6、NSUN7、DNMT2的同源基因。m5C RNA甲基转移酶利用两个保守的半胱氨酸残基进行甲基转移，其中一个(TC-Cys)用于形成共价加合物，另一个(PC-Cys)用于m5C催化后底物的释放(King & Redman, 2002)。
利用CRISPR-Cas9，引入了nsun-1 (mj473)、nsun-2 (mj458)和nsun-4 (mj457)中TC-Cys转化为丙氨酸的突变。这些突变体以及先前报道的nsun-5敲除突变体(tm3898)都是可存活的，并产生可存活的后代，这表明m5C甲基转移酶的个体活性对C的存活并不是必不可少的。
此外，发现NSUN-2是m5C的主要来源(占总含量的88%)，而hm5Cm位点仅来自秀丽隐杆线虫中的NSUN-2靶点
Schosserer等人证明，在秀丽隐杆线虫中，26S rRNA的C2381位点被NSUN-5在碳-5位点甲基化，参与寿命调节(Schosserer et al.， 2015)。然而，该生物的m5C甲基体仍有待确定。因此，我们使用noNSUN菌株作为全转录组亚硫酸氢盐测序(WTBS)分析的阴性对照(Legrand et al.， 2017)，目的是在单核苷酸分辨率下确定线虫RNA中m5C位点的定位。
作者鉴定了26S细胞质rRNA C2982和C2381位点的C5甲基化以及18S线粒体rRNA C628和C632位点的C5甲基化(图2A)。通过对不同生物的rRNA比对，我们发现位置C2982是保守的NSUN1靶标(Sharma et al.， 2013)，而C2381，正如之前报道的，是保守的NSUN5靶标(Schosserer et al.， 2015;Sharma等，2013)。我们使用亚硫酸氢盐测序(BS-seq)方法在单个突变体中进一步确认了这些位点的特异性(补充图2A, B)。有趣的是，其他组之前已经确认了这些位点的特异性
二级结构预测表明，甲基化位点经常出现在一个“铰链”的环境中，或在茎环的基础上
预测m5C甲基化ncrna的二级结构。
红点表示甲基化位置。由Predict a second Structure Web Server (David Mathews Lab, University of Rochester)预测的结构是使用默认数据生成的最低自由能量结构。
NSUN-4是线虫线粒体中的多位点特异性tRNA/ rrna -甲基转移酶
为了深入了解m5C缺失导致的转录和翻译差异，还进行了转录组和核糖体分析
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