Article title：Shell Biosynthesis and Pigmentation as Revealed by the Expression of Tyrosinase and Tyrosinase‑like Protein Genes in Pacific Oyster (Crassostrea gigas) with Different Shell Colors

期刊：Marine Biotechnology

发表时间：2021

通讯作者：李琪

Tyr      A member of the type-3 copper protein superfamily

Typ-2  Tyrosinase-like protein 2

摘要

对软体动物颜色多态性的认识要得益于近百年来收集者和科学家们的工作，然而关于贝壳潜在的色素沉积的分子机制的了解仍然较少。在黑色素的生物合成中，酪氨酸酶是一个关键的限速酶。在这里作者使用广泛的多组学数据定位了太平洋牡蛎中两个酪氨酸酶基因，包括tyrosinase and tyrosinase-like protein 2 (Tyr and Typ-2 respectively)，并且调查了白色壳牡蛎和黑色壳牡蛎在成年以及胚胎形成阶段的酪氨酸酶的表达模式。组织表达分析结果显示两个酪氨酸酶基因在外套膜中都存在特异性表达，并且Tyr and Typ-2者两个基因在外套膜的边缘地区的表达水平要显著高于中间部分。除此以外，与白色壳牡蛎相比，Tyr and Typ-2是黑色壳牡蛎中的特异性基因。原位杂交实验表明Tyr 基因在牡蛎的外褶皱的内表面检测到了比较强的信号，而Typ-2的信号主要位于外褶皱的外表面。在胚胎和幼虫发育时期，在眼点幼虫时期检测到了Typ mRNA较高的表达水平，而Typ-2主要在担轮幼虫和早期D-形幼虫时期表达。此外，酪氨酸酶的活性在外套膜的边缘地区的水平要显著高于中间部分。这些发现都表明酪氨酸酶基因与贝壳的色素沉积有关，并且Typ-2似乎不仅在贝壳棱柱层的形成而且在贝壳的色素沉积过程中发挥了关键的作用。特别是Typ-2基因可能与担轮幼虫初生的无钙化的壳有关。这项工作对于太平洋牡蛎贝壳的形成以及色素沉积的分子机制研究提供了有价值的信息。

前言

水生动物（aquatic animals）多样化的外表面颜色是最直观（ intuitive phenotypic trait）的表型性状，也是影响消费者在海鲜市场的消费偏好和价格的因素之一。然而相对于植物、脊椎动物和一些特定的无脊椎群体，许多软体动物的壳的形成以及色素沉积机制仍未被完全的的阐明。尽管壳色可以被生物化学、底物以及营养等因素所影响，在双壳类和腹足类（bivalves and gastropods ）的育种研究中表明在很多物种中，壳色的多态性是一个可遗传（ heritable ）的性状，并在一些研究中显示它的遗传模式与一个或两个显性基因座（ loci with dominance ）有关。

最近公布了大量软体动物的壳的形成和色素沉积相关的转录组、蛋白组和基因组的数据。一些可能对贝壳色素沉积有一定控制作用的基因也被鉴定到，尽管在某些研究中不排除这些基因中的一部分基因可能与生物矿化有关。在珠母贝中的一项研究表明，珍珠的颜色受到了与钙化层生物矿化的相关基因 的一定的影响。这些研究为贝壳形成和色素沉积的分子和遗传分析提供了有效的资源。

软体动物的大部分色素着色都是由黑色素、类胡萝卜素和四吡咯合成（tetrapyrrole synthesis）途径的产物造成的。他们之中，黑色素的在自然界中分布最广泛的色素。在软体动物中，黑色素是由大脑皮层（pallial area）和外套膜边缘地区的上皮细胞（epithelium ）分泌产生的。尽管与黑色素合成的完整的通路仍然未知，但有几个酶在软体动物黑色素的调控和产生的过程中被证明具有重要的的作用。可以说（Arguably）酪氨酸酶是最重要的酶之一。

酪氨酸酶是3型铜蛋白超家族的成员，具有两个保守的铜结合结构域Cu (A) and Cu (B)。 高水平活性的酪氨酸酶与黑色素的产生存在正相关，这可能是由于已经报道的事实酪氨酸酶是黑色素合成过程中重要的限速酶。在扇贝中，酪氨酸酶被发现在血细胞、卵子以及外套膜中都具有活性。在少数的软体动物中，酪氨酸酶被认为不仅在黑色素合成而且在贝壳基体（shell matrix ）的形成以及棱柱层（prismatic layer ）的色素沉积中都发挥了重要的作用。最近在企鹅珍珠贝（Pteria penguin ）中的一项研究表明酪氨酸酶负责黑色素的合成以及颜色的形成。有学者发现在三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）中 HcTyr and HcTyp-1 可能与珍珠颜色的形成有关。相反的是，在马萨特兰珠母贝（ P.margaritifera）中鉴定到了几个与黑色素形成相关的基因，并且ZINC基因（酪氨酸酶相关蛋白的同源物）在全部白化的壳中表达上调，但在正常的黑壳以及半白化的壳的样本（half-albino specimens）中表达下调。

太平洋牡蛎作为双壳贝类中的代表性物种在全世界广泛的养殖，由于其经济性和生态重要性以及合适的生物学特性使得它是海洋软体动物研究的潜在模型。作者通过对太平洋牡蛎的选择育种，获得了四个不同壳色的家系（金黄、白色、黑色和橘色）。对不同壳色的太平洋牡蛎的转录组研究表明在外套膜中有12个编码酪氨酸酶相关基因的转录本，表明在这个物种进化的过程中这个基因家族发生了扩张。最近，使用细菌表达dsRNA策略对CgTyr进行knockdown可以抑制（block）太平洋牡蛎中壳的生长以及壳色的形成，表明酪氨酸酶在壳基体的形成(assembly)和成熟（maturation）中发挥了至关重要的作用。有学者推测酪氨酸酶基因可能在正常太平洋牡蛎幼虫壳生物发生的初期阶段具有一定的功能。然而，在太平洋牡蛎中，酪氨酸酶是否作为重要的调控者来控制黑色素的生物合成以及成体的贝壳形成的研究目前很少。此外，在牡蛎幼虫壳的色素沉积以及黑色壳的发育中这些基因是否发挥了关键的作用仍然是未知的。

在这个研究中，作者进行了多组学数据挖掘并在太平洋牡蛎基因组中鉴定到了两个酪氨酸酶基因，包括(Tyr) LOC_105324827和(Typ-2) LOC_105344040，作者又进一步对太平洋牡蛎进行了选择性育种，并使用白色壳牡蛎和黑色壳牡蛎为研究模型来调查这两个基因与贝壳的形成和色素的产生之间的潜在相关性（potential involvement ）。

使用到的实验方法

测序分析、荧光定量、组织原位杂交、全组织包埋原位杂交、酪氨酸酶活性测定

结果

一、太平洋牡蛎中Tyr and Typ‑2 两个基因的测序分析

作者对太平洋牡蛎里的Tyr and Typ‑2 这两个基因与其他双壳类物种进行了序列比对，并且阐述了与各个物种之间的序列相似率以及在进化树上的分支。氨基酸序列比对结果揭示了一个保守的铜结合结构域Cu (A) and Cu (B)，含有六个高度保守的组氨酸残基。Tyr and Typ‑2 编码的多肽分别包含699和658个氨基酸。对信号肽的进一步分析揭示了太平洋牡蛎Tyr and Typ‑2 这两个基因除了有一个CuA/CuB 结构域外，还有一个跨膜区域（transmembrane region）。

不同物种的Tyr and Typ‑2 基因的进化树分析揭示了酪氨酸酶的进化关系，All tyrosinases of shellfish referred, including C.gigas, were grouped into a close cluster, but some speciesshowed a low support. The tyrosinases from D. rerio and M.musculus were classified to a vertebrate clade.

二、太平洋牡蛎组织中酪氨酸酶的表达谱

作者对黑壳牡蛎组织中的Tyr and Typ‑2 基因的表达模式通过RT-qPCR进行了分析。在外套膜中这两个基因被检测到了显著高表达，而在其他组织中表达量十分低。为了调查酪氨酸酶基因在壳色形成中的作用作者首先对这两个基因在外套膜不同区域的表达进行了分析，结果如下图显示这两个基因在外套膜不同的区域具有相似的表达模式，都在外套膜的边缘地区显示出了较高的表达水平。有趣的是，相比于外套膜的右边缘区域Tyr 在外套膜左边缘的前侧发现有较高的表达量，而相反的是，Typ‑2主要的右边缘的前侧表达。 这两个基因在黑色壳牡蛎和白色壳牡蛎中的表达模式相似，但在黑色壳牡蛎中的表达水平要显著高于白色壳牡蛎中的表达水平。

三、太平洋牡蛎从胚胎到幼虫的发育时期酪氨酸酶的表达谱

Tyr基因的转录本在眼点幼虫时期高表达，但在其他时期几乎不表达。相反的是Typ-2基因的转录本主要在担轮幼虫时期以及早期D形幼虫时期表达，特别是在担轮幼虫时期高表达。在幼虫发育时期，从D形幼虫到眼点幼虫的这个阶段，Typ-2基因的表达发生了快速的下降。

四、在太平洋牡蛎的外套膜中酪氨酸酶的定位

原位杂交结果显示两个酪氨酸酶基因表现出了不同的表达模式，这与荧光定量的结果一致。在外套膜边缘区域检测到了大量的Tyr and Typ‑2 正向信号，而在中间部分却没有检测到。结果还显示Tyr 基因无论是在黑壳牡蛎还是白壳牡蛎中都在外褶皱的内表面表现出强烈的信号。而相反的是Typ‑2基因在外褶皱的外表明检测到了强烈的信号。

五、酪氨酸酶在太平洋牡蛎中从胚胎到幼虫发育阶段的定位

Typ‑2转录本的信号最开始是在担轮幼虫时期，此时的表达区域为全壳。至早期D形幼虫时期，Typ‑2的转录本信号能在壳的边缘区域以及铰链区域检测到，但在壳的中间区域检测不到，并且在随后稍晚的阶段中出现了显著的下调且很难检测到。

六、太平洋牡蛎中酪氨酸酶的活性

在所有颜色的牡蛎中，酪氨酸酶在外套膜边缘处的活性要显著高于中间区域。值得注意的是，在白壳牡蛎外套膜中间区域的酪氨酸酶的活性要高于黑客牡蛎的外套膜中间区域。

讨论

酪氨酸酶和酪氨酸酶相关的蛋白都是3型铜蛋白超家族的成员，3型铜蛋白可以根据结构域的结构以及保守的残基被分为3个亚群 copper-binding sites–secreted (a), cytosolic (b), and membrane-bound (c)。在太平洋牡蛎中，酪氨酸酶包含大量的基因家族扩张。在这个研究中，Tyr and Typ‑2这两个基因被鉴定到。这两个基因的蛋白序列包含重要的含有CuA and CuB的铜结合位点的酪氨酸酶结构域，被认为是用于催化的位点。太平洋牡蛎中的Tyr and Typ‑2这两个基因与其他软体动物中的酪氨酸酶显示出高度相似性，这表明他们都属于酪氨酸酶基因家族，同样的这一结论也通过系统发育树被证实。

有研究表明酪氨酸酶基因在不同的生理学过程中发挥了关键作用，包括色素合成、角质层硬化(sclerotization of the cuticles)、氧气运输(oxygen transport)和先天免疫(innate immunity)。组织特异性表达分析揭示了Tyr and Typ‑2这两个基因在外套膜中的表达水平更高，这一现象似乎也表明它们对贝壳的生物矿化以及色素沉积具有一定的贡献。Tyr和Typ-2的基因表达主要局限于外套膜边缘，包括前侧和后侧，在中间区域中几乎检测不到。在软体动物贝壳中，贝壳层的沉积似乎受外套膜不同区域内基因的区域化表达控制 。在这个研究中，作者发现酪氨酸酶基因主要表达在外套膜中，外套膜是一个与外壳直接接触的器官，被认为产生外壳色素 。Tyr and Typ‑2在黑壳中的高表达证实了这两个基因在壳的色素 沉积中的重要性。同样的在企鹅珍珠贝中，PpTyr显著增加了黑色素的形成，表明酪氨酸酶决定了黑色素在企鹅珍珠贝中的合成。在斑马鱼中对Tyrp1的 knockdown实验结果导致棕色的形成而非黑色并伴随有黑素体缺陷，表明真黑色素的形成依赖于Tyrp1的存在。在软体动物中，外套膜可以促进贝壳的沉积，主要是与多种多样的大分子蛋白质的钙化、基地蛋白质的分泌以及其他分泌因子有关。事实上，Tyr和Typ-2是在外套膜的外褶皱处表达，这也进一步的突出了酪氨酸酶基因在色素沉积中的潜在作用。此外，黑色色素组织可能具有较高的酶活性，因为黑色素合成量与酪氨酸酶活性呈正相关 。Typ-2在担轮幼虫阶段高表达，这个时期恰好是非钙化贝壳的初始形成时期，因此作者推断Typ-2可能与非钙化贝壳的形成有关，在幼虫壳的生物发生中起作用。

总的来说，作者在这个研究中鉴定并描述了太平洋牡蛎中两个酪氨酸酶基因。系统发育和序列特征分析确认了它们的身份和进化状态。更重要的是，在不同外套膜区域以及不同壳色中酪氨酸酶的表达谱证明它们在贝壳生物合成和色素沉积中发挥了重要的作用。特别是Typ-2基因与担轮幼虫的非钙化壳的初始形成有关。这项工作对于太平洋牡蛎壳的形成以及色素沉积的分子机制提供了有价值的信息。