缓冲液

缓冲溶液（buffer solution）指由“弱酸及其共轭碱之盐类”或“弱碱及其共轭酸之盐类”所组成的缓冲对配制的，能够在加入一定量其他物质时减缓pH改变的溶液。

前述定义中之所以要两种成对物质，是因为反应可以同时朝向酸或碱来缓冲，举例醋酸与醋酸钠的混合溶液就是缓冲溶液。若加盐酸，pH不会下降太快，因为盐酸会跟醋酸钠反应，生成醋酸。相反，若加氢氧化钠，pH也不会增加太快，因为氢氧化钠会跟醋酸反应，生成醋酸钠。 在许多化学反应中，缓冲溶液被用于使溶液的pH值保持恒定。 缓冲溶液对生命的产生与进化具有重要意义，因为多数生物都只能在一定pH范围内生长，例如血液就是一种缓冲溶液。

生物缓冲液有很多种，这里我们只讲常见的几种，从它们的化学性质，注意事项，具体用途到最重要的，如何确定哪种缓冲液最适合你的实验。

1. 三羟甲基氨基甲烷Tris，它是应用最广泛的缓冲液，其溶液呈弱碱性，25℃下的pKa为8.06，pH缓冲范围：7.0-9.0，广泛应用于生物化学、分子生物学、涂料等领域。

储存方法：Tris缓冲液容易吸收空气中的二氧化碳，需要密封储存。

三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl，是Tris的盐酸盐形式，其溶液呈酸性。

Tris缓冲液表 - pH与温度的关系：

2. 3-吗啉丙磺酸MOPS，是生物化学和分子生物学中常用的一种两性离子缓冲液，结构类似于 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）。MOPS 的有效 pH 缓冲范围为 6.5-7.9，pKa=7.2（25℃），其 pKa 比 MES（pKa=6.1）更接近生理 pH7.4，因此更适合用做生理相关的缓冲液，如用于哺乳动物细胞的培养（建议使用浓度应≤20 mM）、RNA 变性琼脂糖凝胶电泳实验（以 20 mM 的浓度使用于甲醛凝胶效果较好）、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳实验等。MOPS会干扰Folin蛋白分析，含葡萄糖的MOPS溶液经高压灭菌会导致其部分失活。

储存方法：MOPS粉末可以室温稳定保存数年。长时间放置可能会结块，不影响其使用和化学性质。

注意事项：MOPS 缓冲液可于2~8℃保存至少 6 个月，用0.2 μm滤膜过滤除菌，不推荐高压灭菌。如需配制无核酸酶的MOPS 溶液，可先对水进行高压灭菌后，再加入粉末溶解。

3. 4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES，是可满足于所有生物学研究的最佳缓冲液之一，是一种两性离子有机化学缓冲液，和MES、MOPS一样都属于“Good”缓冲液。PH缓冲范围为6.8-8.2。

HEPES缓冲液常用于细胞培养的缓冲体系，常用工作浓度为10-25mM；与无机碳酸氢盐缓冲液相比，在组织或者器官培养中表现出更好的pH控制能力。它还用于等电聚焦电泳实验。用作电镜观察蛋白沉积技术合适的缓冲体系，它不会对金属基板造成负面影响。用作定量和选择性测定抗原-抗体反应的缓冲液，不适合用在福林酚蛋白测定，但不会影响Biuret蛋白定量分析。

储存方法：HEPES缓冲液在2-8℃下可保存1年。

注意事项：HEPES缓冲液运输时需要加冰袋。但储存时避免冷冻，否则会有盐类物质析出。

4. N-三(羟甲基)甲基甘氨酸Tricine，是一种两性离子缓冲液，名字由Tris和glycine衍生而来，结构类似于Tris，但是高浓度具有比Tris更弱的抑制性，也是“Good”缓冲液之一，最初开发用于提供叶绿体反应的缓冲体系。Tricine的有效pH缓冲范围为7.4-8.8，pKa=8.1（25 ℃），常用做电泳缓冲液，以及用来重悬细胞沉淀。Tricine具有低负电荷和高离子强度的特性，非常适用于电泳分离1~100 kDa的低分子量蛋白。基于萤火虫荧光素酶的ATP分析实验中，比较10种常见的缓冲液，Tricine（25 mM）表现出最好的检测效果。另外，在自由基诱导的膜损伤实验中，Tricine还是一种有效的羟自由基清除剂。

运输和储存方法：室温下即可。

注意事项：Tricine缓冲液建议过滤除菌。对于分子生物学应用，可先用DEPC处理水，然后加入缓冲液如Tricine，因DEPC与氨基会发生反应。

如何确定哪种缓冲液最适合你的实验？

生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲液都可能产生不需要的化学反应。

硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。

柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。

磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。

三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想。

有用的公式

重量百分比（w / v）：（%所需的缓冲液/ 100）×最终缓冲液体积（ml）=所需起始材料克数。

摩尔解决方案：所需摩尔浓度x 分子量 x 溶液最终体积（L）=所需克数

Henderson-Hasselbach 方程