由日本iPSC领域的大牛2019年发表在Physiological Reviews上的一篇综述：诱导多能干细胞及其在人类疾病和发育模型中的应用，系统性地梳理了从iPSC的起源到前沿应用的一系列重要事件，是入门了解诱导多能干细胞领域不可不读的文章
Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development | Physiological Reviews

以下为IV、V、VI部分翻译（水平有限，仅供参考）：

---

四、医疗应用

A.细胞疗法

在诱导多能干细胞的医疗应用中，对患者最直接的影响是可能出现新的细胞疗法和药物发现。临床分级的诱导多能干细胞分化为祖细胞或体细胞，为开发治疗各种疑难疾病的新药提供了希望。许多基于ESC的I期和II期临床治疗正在进行中(342)。其中包括糖尿病、PD、心脏梗塞、脊髓损伤等，但随着iPSC技术的发展，这一名单有望大幅扩大。

去年，首次报道了基于ipsc的细胞治疗，并用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)(198)。通常，在AMD中，患者的视线中心会出现一个模糊的区域，随着黄斑的进行性变性而扩大。在iPSC研究中，从患者自身的成纤维细胞制备的自体iPSCs制备视网膜色素上皮细胞，并在不使用免疫抑制剂的情况下作为薄片移植到视网膜下。1年后证实移植的有效性和安全性。虽然这种治疗并不是为了治愈，但视力稳定，这表明这种疾病的退行性影响至少已经减缓。

从免疫排斥的角度来看，自体诱导多能干细胞来源的细胞被认为是最安全的。然而，上述报告的两个结果鼓励了一种基于诱导多能干细胞的替代治疗策略。首先，治疗的费用和时间对一般治疗来说是不可行的。研究人员花了大约1年的时间来生成诱导多能干细胞，确认它们的安全性，然后将它们分化成用于移植的视网膜细胞，这一过程耗资近100万美元(美国)。其次，另一名患者计划接受同样的手术，但在从患者的成纤维细胞中重新编程的诱导多能干细胞中发现了不规则现象后，手术被取消了: 在DNA拷贝数中发现了三个畸变。值得注意的是，突变与致瘤性无关，诱导多能干细胞通过了大鼠的致瘤性试验。然而，出于谨慎的考虑，患者接受了标准的抗血管表皮生长因子治疗。

因此，如果第二名患者仍接受自体手术，则需要一年时间。 （实际上，随着安全标准的明确和 iPSC 生成方案的改进，1 年的时间可能会缩短，但也不会缩短太过）然而，这一结果并不否定基于 iPSC 的治疗的概念，因为同种异体（allogeneic）iPSCs 仍然可以使用。因此，正在准备由健康捐赠者制成的 iPSC 库存。这些 iPSC 是从人类白细胞抗原 (HLA) 纯合供体的血液中产生的，因为这些细胞有望将移植后组织排斥的风险降至最低（图 6）。出于这个原因，负责库存的机构正在与红十字会和其他血液组织合作，以确定符合条件的献血者 (10)。一个主要挑战是确保储存的细胞服务于广泛的人群。据估计，100 条 HLA 纯合 iPSC 系可以服务于 78% 的北欧人，但其他群体的匹配数量下降（亚洲人为 63%，西班牙裔为 52%，非洲人为 45%）(93, 346)。 MHC匹配同种异体移植的可行性已在猴子身上得到证实，其中iPSC衍生的心肌细胞用于治疗心肌梗塞模型。所有接受者的心脏功能均得到改善，移植物没有免疫排斥反应 (307)。最近，在猴子身上移植 MHC 匹配的同种异体 iPSC 衍生神经元的实验证实，与 MHC 不匹配的移植物相比产生了更少的免疫抑制 (224)。

图 6. 由于基于自体诱导多能干细胞 (iPSC) 的疗法所需的成本和时间，正在寻求同种异体策略。为了最大限度地增加受益患者的数量，iPSC 正在从具有纯合人类白细胞抗原 (HLA) 的健康供体中制备。纯合 HLA iPSC 以临床级别存储，并根据要求分发给医疗机构。这些研究所将细胞分化成相关的细胞类型，用于基础研究和临床应用。在上图中，由于 HLA 匹配，供体 iPSC 只能用于四名患者中的一名。由于人口统计，准备为整个人口服务的 iPSC 库存所需的捐助者数量因国家/地区而异。为了加快供应，分销商正在与红十字会和类似组织合作，以确定和招募捐助者。

作为回应，进行 AMD 研究的研究人员决定停止自体 AMD 疗法，转而开始同种异体疗法。对于接近 PD 临床试验的基于 iPSC 的疗法正在进行类似的转换 (225)。大量研究表明移植的人类胎儿中脑神经元在 PD 患者中的治疗益处持续了十多年 (14)，为基于同种异体 iPSC 的方法提供了范例。最近的一项临床前试验表明，移植到灵长类动物 PD 模型中的人类 iPSC 衍生的中脑多巴胺能神经元实现了良好的功能，并且在观察 2 年后没有引发严重的免疫反应 (149)，这被认为是临床试验批准的最后一步。

在某些情况下，同种异体基因疗法是唯一的选择。血小板减少症需要定期输注同种异体血小板。虽然这种疗法传统上依赖于捐赠者，但预计捐赠者可能会在下一代供不应求多达 20% (144)。此外，这种形式的血小板疗法存在感染和免疫反应的风险。由 iPSC 制成的永生化巨核细胞系 (iMKCL) 有望解决这些问题 (234)。因为 iPSC 和 iMKCL 可以从选定的 HLA 同源供体中制备，所以它们可用于制造可服务于任何患者的同质血小板批次。血小板治疗的另一个问题是血小板输注困难。为了解决这个问题，已经提出了通过使用基因组编辑技术使 HLA 沉默的 HLA-null 血小板 (21)。基于 iPSC 的血小板疗法有望在未来几年内惠及患者。

虽然仍处于实验阶段，但癌症免疫疗法也可能从 iPSC 技术中受益匪浅。癌症免疫疗法的一个常见挑战是 T 细胞耗竭。衰竭状态描述了与肿瘤结合但不能发挥细胞毒活性的 T 细胞。疲惫是对慢性感染的一种反应，被认为可以保护身体免受过度免疫活动的影响 (12)。几项研究发现，使用 iPSC 技术，T 细胞可以从疲惫状态重编程 (243, 352)。与其他基于 iPSC 的疗法相比，该策略的一个重要区别是细胞来源的保真度。 T 细胞在其发育过程中经历随机 T 细胞受体 (TCR) 重排。如果重编程的原始体细胞群是具有对靶抗原有反应的 TCR 的 T 细胞，则可以避免这种重排。因此，在这些疗法中，ESCs 是不实用的。在使用 iPSC 技术进行操作后，其他免疫细胞群也显示出更强的抗癌活性(109)。

最近，两组使用囊胚互补试验来展示 iPSC 技术在异种器官生长方面的潜力。囊胚互补包括敲除对靶器官发育至关重要的基因并注射 PSC，这可以弥补丢失的基因 (42)。Nakauchi 小组已经展示了如何使用囊胚互补和 iPSC 在小鼠中产生大鼠胰腺和在大鼠中产生小鼠胰腺技术 (157, 381)。此外，虽然它们不产生异种器官，但 Belmonte 小组证明人类 iPSC 可以移植到猪和牛植入前的囊胚中，这表明在动物身上产生人体器官的潜力可以用于移植和其他患者护理 (374) .伦理学家发现，公众对此类医学研究的容忍度取决于如何提出问题以及要移植哪些器官（298）。

去细胞化是另一种用于制备器官的方法。在这里，洗涤剂被灌注以仅留下由细胞外基质组成的器官的 3D 支架。虽然这种方法已经成功地创建了几种器官类型，但很少有研究表明 PSC 在植入残留支架时会增殖和分化 (282)。

另一方面，3D培养的自组织取得了更大的成功，一种由PSC衍生的祖细胞自发重建所需器官的方法。使用这种方法，研究人员已经制备了视杯、垂体腺、肠组织、肾组织和大脑皮层(72、73、312、321、332、334)。虽然患者来源的细胞模型为发病机制提供了新的见解，但一些器官的发育和疾病状态可能取决于细胞非自主因素，只有在适当的微环境中得出细胞类型时才能观察到这些因素(160)。3D培养适合研究这种情况。

B.药物发现

iPSCs可能超过ESCs临床应用的另一种方式是药物发现。基于上述人类iPSC疾病模型，研究人员可以搜索标记疾病发展的早期扰动，而不是使用其他患者样本来识别。神经退行性疾病大部分是在疾病在分子水平上进展之后才表现出症状的。在帕金森病患者中，据估计，在诊断时~50%的多巴胺能神经元已经丢失[16]，这表明患者标本对于寻找预防性化合物没有用处。在第一份人类iPSC报告的短短几年内，研究人员将iPSC模型用作药物发现的平台(173)，现在仅神经疾病就有至少25种新的候选药物被发现(9)。

进行性骨化性纤维发育不良(FOP)估计只有几千名患者。这种疾病的特征是软骨的异常骨化。一个iPSC模型发现了FOP的一种新的分子机制。Actin-A，通常转导TGF-β信号通过与FOP患者中突变的BMP受体ACVR1相互作用，激活重编程的患者细胞中的BMP信号(图7A)(111)。后来，同一研究小组将高通量筛选系统应用于相同的模型，发现雷帕霉素rapamycin可以防止条件性表达人类ACVR1 FOP突变的小鼠的骨化，此后宣布进行临床药物试验(110)。雷帕霉素是一种被批准的药物，有大量关于其在人体内的剂量和效果的数据。

图7. A: 进行性骨化性纤维发育不良(FOP)模型。左X光图像显示移植FOP患者诱导的多能干细胞(iPSC)来源的间充质基质细胞前小鼠的后腿。FOP患者在右后腿注射iPSC来源的间充质基质细胞，导致那里的骨骼异常生长。另一方面，在左后腿注射经过基因矫正的FOP患者IPSC来源的细胞并没有引起异常的骨骼生长。互补分析发现，未矫正的细胞中mTOR信号转导较高。小鼠模型导致雷帕霉素被发现为候选药物。这幅漫画突出了右图中的不同之处。
B：将死亡性发育不良1型患者的IPSCs分化为软骨细胞。软骨细胞COL2和Acan等细胞外基质(ECM)基因表达不足，导致ECM蛋白合成不足(左)。在培养中加入他汀类药物后，表达恢复到正常水平。刻度尺，50米。

用于FOP的雷帕霉素的发现表明iPSC在药物重新定位方面具有非凡的潜力，据估计，这将使药物上市的成本和时间降低到药物发现的三分之一(145)。第一种通过iPSC研究进入临床阶段的药物是ezogabine。Ezogabine是一种被批准的治疗癫痫的药物，但使用来自家族性ALS患者的ipscs的研究表明，它可以通过调节Kv7.2/3类钾通道的类似分子机制发挥积极作用(208)。值得一提的是，这一发现是在没有使用动物模型的情况下得出的。其他使用iPSCs进行药物重新定位的例子也有报道。巧合的是，最近的一项也是用于ALS的治疗。抗癌药物博苏替尼bosutinib被证明能促进家族性和散发性ALS患者IPSCs诱导的运动神经元存活(127)。使用iPSC模型进行药物重新定位的另一个例子是有证据表明他汀类药物可以促进骨骼发育不良症的骨生长(385)。在这里，iPSC是由患有I型死亡发育不良症的患者来源的，这种疾病会导致严重的肢体短小和肺发育不全，具有很高的死亡风险。体外细胞模型显示，在软骨分化培养液中加入洛伐他汀可促进关节软骨转录因子和细胞外基质蛋白的表达，这些转录因子和细胞外基质蛋白与正常软骨发育相关(图7B)。

最后，通过iPSCs重新定位药物可以节省成本，这鼓励对已批准药物的协同效应进行复杂的研究。用于治疗帕金森病的多巴胺激动剂溴隐亭、用于治疗癫痫的抗癫痫药托吡酯和抗炎药色甘露的药物鸡尾酒对13名不同AD患者的iPSCs来源的神经元具有抗Aβ效应(164例)。表4提供了受益于iPSC研究的药物重新定位的简短摘要。

---

五、毒理学筛选

许多药物和候选药物尽管通过了动物试验，但由于对人类的未预料到的副作用而未能上市。在药物开发的早期阶段预测对人体的毒性作用可以显著降低成本，但由于缺乏丰富且稳定的人体样本而变得困难。人类 iPSC 的特性为这个问题提供了解决方案。通常，毒理学测试的细胞目标是神经元、心肌细胞和肝细胞。在这三者中，心肌细胞测试有望很快获得国际协调委员会（ICH）对人用药品技术要求的批准。

致死性心律失常是药物退出市场的主要原因之一。 QT 延长通常在致命性心律失常发生之前观察到，例如扭转型室性心动过速 (tdP)，这是一种多形性室性心动过速，可导致心脏骤停和死亡。因此，QT 延长被用作预测致命性心律失常风险的替代指标 (79, 276)。用于评估 QT 伸长率的标准测试是 hERG 测试。在这里，使用过表达钾通道人 ether-a-go-go (hERG) 的非肌细胞系（例如 COS7 细胞），它产生在 QT 间期起作用的快速激活的钾电流，(101)。本试验直接评价药物对hERG功能的抑制作用。它简单而有效，尽管已知有关于 QT 延长和致命性心律失常风险的错误预测的例子 (121)。因为QT间期和心律失常不是单独由hERG通道引起的，而是复杂的多离子通道相互作用的最终结果。例如，chromanol-239A（一种钾通道抑制剂）对缓慢激活钾电流的影响无法通过 hERG 测试检测到。误报也是一个问题。根据 hERG 测试，钙通道阻滞剂维拉帕米阻断 hERG 通道功能，但在体内试验或临床病例中，钙通道的抑制不会导致 QT 间期延长 (94)。

iPSCs 使我们能够研究实际肌细胞中的离子通道行为，而不是在过表达通道的细胞中。已经报道了许多心肌细胞诱导方法，并且人 PSC 衍生的心肌细胞产品是可商购的。使用这些细胞进行毒理学研究被认为比 hERG 测试提供更可靠的预测。事实上，人 PSC 衍生的心肌细胞在色甘醇 293 或维拉帕米测试中比 hERG 测试更可靠 (248, 259)。细胞外场电位持续时间 (FPD) 是 QT 伸长率的标准测量值 (382)。最近，对 60 种药物的 FPD 评估成功地证明了对 iPSC 衍生心肌细胞中 TdP 临床风险的准确预测，灵敏度为 81%，特异性为 87%，准确度为 83% (4)。

尽管 iPSC 技术具有优势，但仍然存在许多挑战。最关键的因素之一是细胞成熟度。尽管存在许多将 iPSC 分化为心肌细胞的方案，得到的心肌细胞是不成熟的，更类似于胚胎中细胞（13）。而成人和胚胎心肌细胞具有不同的特性，后者显示出较浅的舒张内电位和较慢的最大去极化速度（268）。在结构上，心肌细胞显示横管（Ttubules），这是心肌和骨骼肌中的一种特定结构，从肌膜（肌细胞膜）延伸并渗透到肌细胞的中心。然而，在 PSC 衍生的心肌细胞中没有报道明显的 T 小管形成 (180)。因此，正在做出许多努力来产生成熟的心肌细胞。特别感兴趣的是长期、高密度、3D 培养，其中包括机械生理学压力的应用，例如拉伸和/或电子刺激，以及试剂或分子 (162)。

有效药物毒性研究的另一个问题是心脏的细胞异质性。心脏主要由四种心脏细胞群组成：心室、心房、起搏器和传导系统细胞 (140)。其中，心室细胞，尤其是左心室细胞最有价值，因为包括室性心动过速和纤颤在内的左心室心律失常在很大程度上是致命的。迄今为止，尚未得到能有效地从 PSC 中诱导左心室心肌细胞的分化方案。此外，没有用于纯化左心室细胞的特定细胞表面标志物。

目前，使用 PSC 衍生心肌细胞的体外药物毒性试验仅限于细胞水平。通过观察FPD来评估临床TdP风险，这些细胞显示出了准确预测的能力。然而，在某些情况下，检测到FPD延长和短暂性心律失常现象，如早期后去极化和触发活动（132），即使TdP等致命性心律失常从未再现。最近，心肌细胞与非心肌细胞（间充质细胞）的3D培养成功地在体外再现了TdP的发生（147）。该研究进一步证明，三维结构中的异质细胞群对细胞增殖至关重要。这一发现表明，3D环境中的多种细胞类型更真实地反映了体内生理现象。上述局限性可以解释为什么iPSC分析只有效地模拟了少数药物的已知心脏毒性（表5）。

---

六、 结论

2006年iPSC的首次报告表明，使用逆转录病毒系统诱导四因子（OSKM）足以将体细胞重新编程为多能性状态。在该报告发表后的10多年里，需要进行系统发育研究，以展示针对诱导细胞重新编程的许多不同因素的许多不同方法。

其中一些方法适合临床应用，而其他许多方法仅限于实验室。重编程挑战了我们对细胞身份的定义，为研究正常和疾病发展开辟了新的根本可能性。以前只能在死后获取的细胞现在可以通过无害的血液采样从患者身上获取。因此，曾经只在动物模型中测试过的实验化合物现在可以在活的人类细胞上使用，这为药物开发节省了巨大的成本和时间。此外，iPSCs理论上提供了无尽的细胞供应，可用于替换或再生因年龄、创伤或其他原因丢失的细胞。

我们很容易理解iPSC在医学上引起的兴奋，因为它们具有再生潜力，并且有可能得到以前无法获取的细胞。从科学角度来看，与胚胎干细胞一样，它们代表了发育的早期阶段之一，并为胚胎如何成为由数万亿细胞组成的完整机体提供了一个有吸引力的模型。实际上，包括iPSC在内的PSC可靠地模拟正常发育的能力有限。虽然ESC和iPSC都有“多能性”的标题，但研究表明，多能性可以分为naive状态和primed状态（238）。naive状态赋予PSC在植入前阶段囊胚中生成嵌合体的潜力和更高的自我更新能力，而primed状态描述了对谱系分化更高的敏感性。小鼠PSC被认为处于naive状态，模拟胚胎细胞的植入前状态，而人类PSC处于primed状态，模拟植入后状态，使其与小鼠上胚层干细胞（EpiSC）相比更具可比性（图8）。最近的研究表明，在人类PSC中如何获得naive状态（333，339）。然而，即使如此，naive人类PSC似乎与胚胎细胞不一致，因为它们表达胚胎中未见的标记物（52）。此外，甚至小鼠PSC的naive状态也受到了质疑，因为这些细胞显示出与正常发育不一致的表观遗传模式和标记，包括印记控制区的异常去甲基化水平（46，376）。

这些畸变可以进一步解释为什么PSC向某些细胞类型的分化仍然很难实现。特别是，生殖细胞已被证明异常困难。在这一领域，原始生殖样细胞的获得取得了重大进展，尽管它们在小鼠方面比人类更为领先（291）。其中一个原因是EpiSC基本上没有生殖细胞命运的诱导能力，这再次说明了获取naive状态的重要性（107）。这些研究对不孕不育的治疗以及防止疾病相关突变传递给后代有着巨大的意义，而纠正或治疗患者其他细胞中的突变并不能解决这一问题。配子细胞的成功获取也将阐明这些细胞的发展，并在设计婴儿和其他方面带来新一代的伦理挑战。

图 8. 小鼠胚胎干细胞 (ESCs) 和上胚层干细胞 (EpiSCs) 被认为分别代表囊胚的植入前（左）和植入后（右）阶段。这两个阶段在形态上是可区分的。两者的多能性也不同，ESC具有naive多能性，而EpiSC具有primed多能性。只有具有naive多能性的细胞才能形成嵌合体。显示了明场显微镜图像和插图。比例尺，100 微米。

iPSC 为研究多能状态和所有细胞类型的发育提供了独特丰富的资源。随着科学家们掌握了调节多能性和发育的分子机制，我们期望能更好地了解偏离正常发育途径如何导致疾病以及如何纠正这些偏差。 iPSC 技术与 CRISPR/Cas9 系统等其他生物技术的结合将会增强我们治疗疾病的能力 (175)。在第一批人类 iPSC 被报道后不到 10 年，iPSC 的临床应用已经到来。该领域在短时间内的快速扩张表明，未来 10 年将带来一连串令人鼓舞的成功。