人类和动物的胃肠道（gastrointestinal，GI）中定殖着大量多样化的细菌群落，以及其他多样化较少的真菌、病毒、古细菌等生物群落。众所周知，肠道微生物群对宿主生理、新陈代谢和健康至关重要。新一代测序的出现极大地扩展了研究人员对人类、小鼠、家畜和鸟类肠道微生物群落的认识，但是对于鸡肠道中真菌群落的动态变化和来源仍知之甚少。2022年最新发表于中科院一区《Microbiome》期刊的研究论文“Biogeography, succession, and origin of the chicken intestinal mycobiome”全面介绍了肉鸡胃肠道真菌群的生物地理和演替特征，并进一步揭示了影响鸡胃肠道真菌群初始定殖和长期建立的真菌来源。
研究设计
本研究基于ITS扩增子测序方法，对ITS2区域测序得到ASVs丰度表并进行物种注释，系统描述不同日龄鸡（3、7、14、21、27、35和42天）胃肠道真菌群落多样性以及在7个不同肠段（嗉囊、砂囊、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）中的动态变化。同时，利用qPCR进一步研究整个发育周期中，十二指肠、空肠、回肠和盲肠的真菌和细菌种群的绝对丰度动态变化。
此外，本研究还通过对鸡羽毛、运输箱、饲粮等居住环境中的真菌群落多样性统计分析，采用Source Tracker软件来追踪确定鸡胃肠道真菌群落的来源。
主要结果
1、鸡肠道真菌群落多样性
Shannon指数结果表明，鸡GI不同位置真菌群落的多样性发生了显著变化（P < 0.05）（图1a）。PCoA分析结果表明，不同的GI位置真菌群落存在差异性，并通过Anosim的检验分析得到显著性差异结果（P < 0.05）（图1b，c）。
对第42日龄的鸡胃肠道不同位置真菌群落的物种分布情况进行统计分析。在ASV水平上，Fusarium pseudonygamai（F1）、白色念珠菌（F2）和Aspergillus favus（F3）三个ASVs，在所有的GI位置（除了十二指肠和空肠，丰度占比56%和73%）都具有优势丰度，丰度占比在80%以上（图1f）。门水平上，子囊菌门为优势门，在每个GI位置丰度占比高达97-99%（图1d）。42日龄鸡的胃肠道中共鉴定出81个属，赤霉属最丰富（50%以上），其次是曲霉属和念珠菌属（图1e）。
图1 第42天鸡肠道真菌群的多样性。a，肠道真菌群α-多样性的shannon指数。不同肠段真菌群加权（b）和非加权UniFrac距离（c）的PCoA分析图。在（d）门和属（e）以及ASV（f）水平上显示了肠道不同位置的真菌群的平均相对丰度（%），只显示了样本中丰度前5的属和丰度前10的ASVs。
由于真菌群落的组成差异较大，并且在个体动物中存在一些罕见的独特的ASVs，因此本研究将在特定的发育阶段和GI位置存在于至少80%的样本中的ASVs定义为核心真菌物种，比较它们在不同的GI部位之间的差异。本研究中共有26个ASVs被鉴定为核心真菌物种，除十二指肠和空肠外（丰度占比为85%），在每个GI位置的丰度占比均达96%以上。丰度占比前10的核心真菌物种主要以F. pseudonygamai，C. albicans和A. favus为主，剩余的ASVs主要归属于子囊菌门（图2a）。
图2 第42天鸡肠道核心真菌群和微生物总量的概况。a.样本中丰度前10的核心真菌ASVs的相对丰度（%）；b.真菌和细菌群落的绝对丰度以及真菌与细菌基因组拷贝数的比值。
2、鸡肠道真菌群落的动态变化
Shannon指数显示，不同年龄的鸡空肠、回肠和盲肠的总体α多样性发生显著变化。在回肠和盲肠中，多样性在第3、7和14天相对一致，但在第21天显著增加，从第27天到第42天，多样性又稳步下降（图3a）。空肠的变化不明显，多样性在第27天急剧增加，然后在第35天下降，在第42天略有恢复。β多样性分析表明，随着鸡龄的增长，真菌组成发生显著变化（P < 0.05）（图3b，c），且Anosim检验显示差异显著（P < 0.05）。此外，随着鸡的年龄增长，每个GI位置的真菌组成也发生了明显变化（图3d）。
图3 在42天的发育周期中，鸡肠道真菌菌群的多样性和相对丰度的连续变化。a显示肠道真菌群α-多样性的shannon指数。绘制加权（b）和非加权UniFrac距离（c）的PCoA，显示不同年龄段肠道真菌组的β多样性。d，样本中丰度占比前10的真菌ASVs在不同年龄的4个肠段中的平均相对丰度（%）。
在42天的发育周期中，鸡胃肠道核心微生物群中丰度前10的ASVs中，F. pseudonygamai明显是鸡肠道优势菌群，而C. albicans，两种曲霉属物种（A. favus和A. amstelodami）和2种毛孢子菌属物种（T. asahii和T. asteroids）也在每个GI部位持续存在（图4）。
图4 鸡肠道真菌群落的演替和微生物总量。饼状图中显示了样本中丰度前10的核心真菌ASVs的平均相对丰度（%），图上数字分别代表真菌和细菌种群的绝对丰度（每克食糜中基因组拷贝数）以及真菌与细菌基因组拷贝数的比率。
3、鸡肠道中真菌和细菌种群的变化
qPCR绝对定量结果表明，鸡胃肠道内的微生物总量变化显著，真菌与细菌的变化趋势相反（图5a）。每克食糜中总真菌菌群在嗉囊和砂囊中最高，分别为9.1×105和6.2×105/g，然后在十二指肠显著下降（P < 0.05）（0.1×105/g），在整个胃肠道其他部分均保持较低水平（2b和5a）。每克食糜中总细菌菌群从嗉囊的7.8×109/g下降到十二指肠的0.3×109/g，然后在盲肠中逐渐增加到最大的2.7×1010/g。
图5 鸡肠道微生物真菌和细菌的绝对丰度。第42天鸡的GI不同部位真菌和细菌种群的绝对丰度（a）和不同采样天数（b）的四个肠段中真菌和细菌种群的绝对丰度。红色是真菌，蓝色是细菌。
4、鸡肠道真菌菌群的起源
在环境和肠道内容物样本中，丰度前10的ASVs中，F. pseudonygamai（F1）普遍存在于大多数样本中。F. pseudonygamai分别占饲料、笼子和刨花中真菌群落的82.9%、51.9%和17.3%。运输箱和羽毛的F. pseudonygamai水平较低（16.3%和32%），但相对C. albicans（25.6%和18.1%），A. favus（8.1%和4.6%），和A. amstelodami（18.6%和15.3%）来说丰度还是较高的。
图6 鸡胃肠道真菌群的来源。a不同环境和混合肠道样本中10种最丰富的真菌ASVs的平均相对丰度（%）。b不同环境和混合肠道样本类型对鸡肠道菌群初始建立的平均相对贡献（%）。
刨花的真菌群落构成在第3天发生彻底改变，以F. pseudonygamai（84.7%）为主，而第7天的刨花的真菌组成由几乎相等比例的F. pseudonygamai（39.4%）和C. albicans（43.7 %）构成（图6a）。由于孵化日的鸡在收集肠道内容物之前没有进入家禽饲养环境，因此在第0天分析中只将运输箱和羽毛样本作为潜在来源。其中，羽毛占初始真菌菌群的44.7%，运输箱占18.7%。饲料和第0天肠道真菌群作为第3天真菌群的主要真菌来源，分别占65.4%和19.3%，而羽毛和箱子上的真菌则迅速减少至1.8%和5.2%（图6b）。
5、不同研究中鸡肠道真菌菌群的差异
作者将早先已发表的对28日龄鸡肠道真菌群研究结果和本次相同发育阶段的研究结果进行了比较，分析了两次研究中鸡特定GI位置不少于80%样本的核心真菌群的差异。结果表明，两项研究中样本间物种多样性存在显著差异（Anosim，P < 0.05）（图7a）。两项研究4种肠道样本中均存在一小部分物种重叠，而超过一半的真菌ASVs都是独特的（图7c）。在两个研究中，F. pseudonygamai，S. brevicaulis，T. asteroides，S. maydis，A. amstelodami，A. favus和D. hansenii在所有的胃肠道位置都存在（图7c）。
图6 两项研究中鸡核心肠道真菌菌群的差异。非加权（a）和加权UniFrac距离（b）的PCoA。（c）Venn图显示了两项研究中四个肠段的核心真菌ASVs的重叠。图例显示常见的真菌ASVs。
总结
综上所述，鸡胃肠道（GI）不同位置真菌群落的组成结构表现出明显的差异。上消化道（嗉囊、砂囊、十二指肠、空肠和回肠）真菌群落的多样性始终大于下消化道（盲肠和结肠）。
关于肠道真菌菌群的起源，研究结果表明它可能来源于饲料和居住环境。羽毛和运输箱上的真菌是新孵化雏鸡肠道菌群的主要贡献者。居住环境中的菌群，特别是膳食中的真菌，在鸡肠道菌群的结构和功能中起着关键作用。更好地了解鸡胃肠道真菌菌群的生物地理学、演替和起源，将有助于开发管理和控制鸡胃肠道真菌群落的新方法，对于保障鸡群的健康状况以及提高生产性能具有重要意义。
参考文献：
Biogeography, succession, and origin of the chicken intestinal mycobiome. Microbiome, 2022.
DOI:10.1186/s40168-022-01252-9
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