单细胞分析揭示了C1q-high单核细胞对贝赫切特病的促炎作用

贝赫切特病（Behcet’s disease，BD），又名白塞病，是一种慢性血管炎，通常表现为复发性口腔/生殖器溃疡和皮肤病变，以全身免疫异常为特征。然而，目前还缺乏对BD发病机制的全面了解。研究者对BD患者和健康供血者的外周血单个核的细胞(PBMCs) 进行了单细胞测序和Bulk RNA测序并对分离出的单核细胞进行了单细胞测序。研究者观察到BD患者外周血单个核的细胞中单核细胞不仅在数量上会显著增加而且细胞内部也存在明显的转录变化。数据分析显示，BD中C1q-high单核细胞(C1qhi)显著富集；拟时序分析表明，BD单核细胞明显地将其分化向伴随炎症和C1qhi单核细胞的轨迹转移。进一步的实验表明，C1qhi单核细胞可增强吞噬和促炎细胞因子分泌，并且该亚型具有显著的临床相关性。在机制上，激活的干扰素-γ (IFN-γ)信号在BD患者中诱导C1qhi单核细胞增多，而tofacitinib治疗可使C1qhi单核细胞减少。该研究阐明了BD的免疫情况和C1qhi单核细胞对BD炎症增加的重要性，这使它们可作为治疗靶点和疾病的临床评估指标。

文章题目：Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behcet’s disease

中文题目：单细胞分析揭示了C1q-high单核细胞对贝赫切特病的促炎作用

见刊时间：2022.06

期刊名称：PNAS

影响因子：12.779

实验平台：scRNA-seq (10X Genomics)

DOI：10.1073/pnas.2204289119

研究内容

1、BD中外周血单个核细胞的单细胞测序情况

研究者对4例未接受治疗的BD患者和4例健康对照人(HCs)的PBMCs进行了单细胞测序(图1A)。共检测出36190个高质量的细胞，并从5个主要细胞系中的得到了20个细胞群(图1B)，包括髓系细胞(CD33+)、T细胞(CD3D+)、自然杀伤细胞(NK) (KLRF1+)、B细胞(CD79A+)和非免疫细胞系(PPBP+)(图1C，1D)。研究者进一步进行了细胞亚群分析：确定了四种髓系细胞亚型 (图1E)，包括CD14+单核细胞(LYZ+CD14+)，CD16+单核细胞(LYZ+FCGR3A+)，常规树突状细胞(cDCs;CD1C+CLEC10A+)，浆细胞样树突状细胞(pDCs;LILRA4 + CLEC4C +)；8种T细胞亚型，即新生的CD4 T细胞(CD4 T naive;CD3D+ CCR7+)，记忆CD4 T细胞(CD4 Tmemory;CD3D+ CD40LG+)，IFN相关的CD4 T细胞(CD4 T与IFN相关;CD3D+ ISG15+)、调节性T细胞(Tregs;CD3D+ FOXP3+)，先天性的T细胞(先天性淋巴细胞;CD3D+ CD127+ KLRG1+ SLC4A10+)，记忆CD8 T细胞(CD8 Tmemory;CD8A+ GZMK+)，效应CD8 T细胞(CD8 Teffector;CD8A+ GZMB+)、增殖T细胞(增殖T;CD3D+ MKI67+)。

图1. BD患者和健康供体外周血单个核细胞的单细胞测序图谱

2、单核细胞参与BD的系统免疫畸变

研究者整合了scRNA-seq(4例BD患者和4例HCs)与Bulk RNA-seq(9例BD患者和10例HCs)的数据。从Bulk RNA-seq数据中研究者鉴定出了BD中有1,514个上调和325个下调的差异表达基因(DEGs)(图2A)。他们将这些DEGs与scRNA-seq数据中确定的细胞类型进行映射，并发现上调的DEGs在单核细胞和DCs中相对富集(图2B)，而下调的基因在B细胞中富集(图2C)。研究者们还发现：BD患者单核细胞比例高于HCs(图2D)，全血细胞计数数据也进一步证实了这一点(图2E)，这表明单核细胞在BD中起着重要的作用。随后，研究者使用scRNA-seq数据研究了主要细胞系中与BD进展相关的生物学途径。在单核细胞中，最主要的途径是IFN-γ反应、外源性抗原的加工和递呈以及中性粒细胞的激活(图2F和G)。

图2. BD患者PBMCs中的单核细胞异常

3、单核细胞异质性的鉴定

接下来研究者对4名BD患者和4名HCs的PBMCs进行磁珠分选单核细胞(CD14+)，并进行了scRNA-seq。共得到39385个高质量的单核细胞，进一步分析得到了8个细胞群 (图3A)。然后，研究者通过评估高表达基因和相应的富集通路来比较单核细胞所有8个亚型的功能表型(图3B)。8个单核细胞亚型中有5个存在CD14高表达(图3C)。在CD14低表达的3个亚型中，CD16 high单核细胞(CD16 Monos)呈现非经典单核细胞标记物(FCGR3A、MS4A7和CX3CR1)，单核细胞来源的DC (MoDCs)呈现过表达抗原递呈途径和DC特异性基因标记物 (CLEC10A、FCER1A、CST3和CD74)。C1qhi单核细胞(C1Q Monos)高表达补体1q (C1Q基因，包括C1QA、C1QB和C1QC)和巨噬细胞标志物(CD68)(图3C)。接下来，研究者研究了与BD相关的单核细胞组成的差异。对比BD组和HC组的相对细胞比例，他们观察到BD患者C1Q Monos明显增加，MoDCs明显减少(图3D)。通过流式细胞术，他们观察到该亚型的存在，并验证了BD患者的C1Q单核细胞数量(scRNA-seq数据中的C1Q单核细胞数量)增加(图3E、F)。

图3. BD中单核细胞的异质性

4、向C1qhi单核细胞分化的轨迹伴随着炎症

为了探索单核细胞亚型之间的轨迹关系，研究者又做了细胞轨迹分析。拟时序轨迹轴从MHC-II Monos分叉为两个末端:fate 1, C1Q Monos和fate 2, MoDCs(图4A和B)。但这两种分布显著不平衡，BD单核细胞在命运1末端聚集，而HC单核细胞在命运2末端聚集(图4C)。这一结果与BD中C1Q单核细胞增多和MoDCs信号减少相对应(图3D)。研究者又研究了两种分化轨迹下的相关基因表达谱和通路。结果显示：编码炎症细胞因子相关蛋白的基因(ISG15、TNFRSF1B和S100A11)和补体成分(C1q基因)沿着fate 1逐渐上调(图4D)。相反，fate 2显示出抗原呈递基因的变异，包括MHC-II基因(HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ)、免疫球蛋白E受体Fc片段(FCER1A和FCER2B)和DC标记(CLEC10A、CD1C和CD74)(图4E)。途径富集分析发现，fate 1与炎症相关通路相关，如趋化因子信号通路、核苷酸寡聚化域(NOD)样受体信号通路和NK细胞介导的细胞毒性，而fate 2与抗原呈递相关通路相关。参与单核细胞-巨噬细胞转化(RHOC, NR4A1和MAFB)的转录因子(TFs)的表达在fate 1中逐渐增加，最终形成巨噬细胞样亚型(C1Q Monos)，但在fate 2中没有，最终形成MoDCs亚型(图4G)。

图4. 单核细胞亚型的分化轨迹

5、C1Q单核细胞参与BD的高炎症反应

为了测试C1Q单核细胞是否具有促炎特性，研究者分析了单核细胞的三个关键炎症调节能力，包括吞噬、抗原呈递和细胞因子分泌。C1Q单核细胞比其他亚型具有更大的功能(图5A)，这是由BD相关的促炎细胞因子(TNF和IL6)、FcR激活因子(LYN和HCK)、细胞骨架重塑因子(PIK3CG、WASP2和VASP)和MHC-II成分的过表达引起。接下来，研究者检测了单核细胞的吞噬能力。结果表明：BD C1qhi单核细胞比CD16+单核细胞和CD16单核细胞吞噬更多右旋糖酐（图5 B、C）。他们进一步检测了脂多糖(LPS)刺激的单核细胞中促炎细胞因子的产生情况，并观察到BD C1qhi单核细胞产生的IL-6和TNF-α水平显著高于CD16+单核细胞或CD16－单核细胞（图5 D-G）。

图5. C1qhi单核细胞表现出促炎的特性

6、激活的IFN-γ信号刺激了BD中C1qhi单核细胞的扩增

为了了解BD中C1qhi单核细胞扩增的潜在机制，研究者首先分析了BD和HC之间C1qhi单核细胞的DEGs，并确定了BD中254个上调基因和115个下调基因。上调的基因在IFN-γ应答通路中显著富集(图6A)。接下来，研究者做了SCENIC分析，并注意到调节IFN-γ反应途径的转录因子（Transcription Factor，TF）的显著富集，包括STAT1和IRF1(图6B)，这些TF的表达也在BD患者的C1qhi单核细胞中升高。STAT1磷酸化被证实在BD患者的C1qhi单核细胞中显著增加（图6 C）。IFN-γ处理也可显著增加HC单核细胞中C1q基因的表达(图6D)并且可以增加C1qhi单核细胞比例(图6E、F)。

图6. IFN-γ水平的增加导致了BD中C1qhi单核细胞的扩增

7、C1qhi单核细胞将BD患者与健康供体区分开来，并对治疗有反应

为了探索C1Q Monos的潜在临床价值，研究者在他们自己的内部队列(n = 19)和三个已发表的BD患者活跃队列(GSE17114, n = 29；GSE165254, n = 25；GSE70403, n = 58)中挖掘了C1Q Monos高表达基因的预测能力。在三个队列中，C1Q Monos中表达最多的5个基因显著解释了方差，并预测了曲线下面积大于0.7的BD患者(图7A)。因此，C1Q Monos可以在不同的队列中区分BD患者和HC。研究者又调查了通过单核细胞亚型全基因组关联研究确定的BD相关基因，发现这些基因在C1Q Monos中具有最高平均表达水平。此外，C1qhi单核细胞与红细胞沉降率(衡量BD炎症程度的临床诊断参数)呈正相关(结果在补充图，此处未列出)，在疾病活动度评分高的BD患者中所占比例更高(图7B)。总之，这些结果揭示了C1qhi单核细胞与疾病的显著相关性。

此外，研究者还探讨了BD患者的C1qhi单核细胞是否对药物治疗有反应，研究表明：免疫抑制治疗显著降低了同一患者的C1qhi单核细胞(图7 C)。他们接下来测试了C1qhi单核细胞是否对tofacitinib有反应，研究表明：tofacitinib治疗显著降低了IFN-γ刺激的C1qhi单核细胞的转录水平(图7D)和蛋白质水平(图7E)。以上结果为C1qhi单核细胞在监测治疗效果方面的潜力提供了见解，并表明靶向C1qhi单核细胞可能是BD治疗的有效策略。

图7. C1qhi单核细胞区分了BD患者和HCs，并对BD治疗有反应

主要结论

研究者对BD患者和HCs的PBMCs进行了单细胞测序和Bulk RNA测序，测序数据整合发现单核细胞变化显著。随后，研究者对BD患者和HC的PBMCs进行磁珠分选单核细胞并进行了单细胞测序，发现BD患者中C1qhi单核细胞明显增多。并且发现C1Q单核细胞具有促炎特性，且BD中C1qhi单核细胞的扩增是由于IFN-γ水平的增加。在tofacitinib治疗BD患者之后，C1qhi单核细胞会减少。此研究确定了C1qhi单核细胞在BD中的促炎作用，这些数据揭示了BD靶向治疗和临床评估的潜在靶点。 

四. 参考文献

Zheng W, Wang X, Liu J, Yu X, Li L, Wang H, Yu J, Pei X, Li C, Wang Z, Zhang M, Zeng X, Zhang F, Wang C, Chen H, Chen HZ. Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behçet's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jun 28;119(26):e2204289119. doi: 10.1073/pnas.2204289119. Epub 2022 Jun 21. PMID: 35727985; PMCID: PMC9245671.