环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术通过独特的引物设计和链置换酶，可在恒温条件下自动循环合成目标基因，这种技术摆脱了对热循环聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪的依赖，降低了核酸检测的复杂度，1 h 内即可得到实验结果。

LAMP技术原理

1.1 LAMP引物

LAMP 引物在确保 LAMP 反应的特异性及灵敏度方面至关重要，与 PCR 等变温核酸扩增技术针对一段核酸序列不同，LAMP 技术针对靶序列的 F3、 F2、F1、B1、B2 及 B3 区段扩增（图 1）。LAMP 引物分为 4 种，分别为上游内引物(forward inner primer，FIP)、 下游内引物(backward inner primer，BIP)、外引物(F3 与 B3)和环引物(Loop B 与 Loop F)。故仅从引物识别的序列来看，LAMP 技术比普通 PCR 技术具有更高的特异性[1]。

图 1 LAMP 引物位置示意图

Figure 1 Schematic illustration of the location of LAMP primers

1.2 LAMP反应

LAMP 扩增反应主要分为三个步骤，分别是起始结构产生、哑铃状结构生成和循环扩增阶段。反应首先由外引物 B3 扩增出互补链，随后 FIP 与 F2c 结合并启动靶序列合成。由于外部引物 F3 比 FIP 碱基少，且浓度更低，F3 与互补序列中 F3c 杂交，并启动链置换 DNA 合成，在一端形成环状结构。在此基础上，BIP 及 B3 分别引发 DNA 合成，最终产生哑铃状结构。

在 LAMP 循环扩增阶段，内部引物与产物上的环杂交并合成置换 DNA，生成新的茎环 DNA，最终产生花椰菜多环结构及重复反向的茎环结构(图 2)[2] 。由于 LAMP 反应过程中有多种产物产生，所以反应结束后对反应产物进行电泳，出现的是阶梯状条带。

图 2 LAMP 产物茎环结构（A）和多环花椰菜结构（B）

Figure 2 Stem-loop structure（A）and polycyclic cauliflower structure（B）of LAMP product

LAMP 反应产物的检测方法

2.1琼脂糖凝胶电泳检测

电泳分析是确定 LAMP 反应是否发生的方法之一，LAMP 反应最后的产物是茎环和花椰菜状结构 DNA 的混合物，导致 LAMP 产物的电泳结果呈现阶梯状条带。由于电泳操作需要将 LAMP 反应产物暴露出来，该过程容易造成气溶胶污染。除此以外，电泳法耗时久、操作繁琐，故对 LAMP 产物进行凝胶电泳的方式并不常用。

2.2焦磷酸镁白色沉淀观察法

在 LAMP 反应中， 每一分子 dNTP 与 DNA 双链结合，就会释放出一分子的焦磷酸根离子(ppi)，LAMP 体系中引入了镁离子(Mg 2＋)，焦磷酸根离子与镁离子结合会产生短暂离心下可观察到的白色沉淀—— 焦磷酸镁(Mg2P2O7)。由于 ppi 的量和 dNTP 结合双链的量一一对应，产生的白色沉淀和反应中生成的双链 DNA 的量呈正比，但只有当反应体系中 dNTP 的量达到 0.5 mol/ L 时才能用肉眼观察到白色沉淀，所以该方法具有一定的主观性。同样的，若体系中有非特异性扩增，也会产生白色焦磷酸沉淀，无法判断是目标产物还是非特异性扩增产物，故该方法仍存在一定局限性。

2.3浊度检测

浊度检测是目前 LAMP 研究中使用最多的方法。其原理是在 650 nm 光源下对管内某个位置产生的白色焦磷酸镁沉淀进行浑浊度检测。目前实时浊度仪仍以荣研化学株式会社生产的 LA—320C 和 LA—500 浊度仪为主。主要区别在于 LA—320C 最多同时检测 32 个样品，而 LA—500 能同时检测 96个样品。由于浊度仪价格昂贵，很难在基层广泛使用。

2.4比色检测(SYBR Green 染色法)

SYBR Green 仅在与双链 DNA 结合时才会发出特有的荧光。随着 LAMP 反应中产物不断蓄积 ，SYBR Green 不断与双链 DNA 结合产生荧光，荧光信号的强弱与产物的量呈正相关。当反应过程中有非靶序列的双链片段产生时，SYBR Green 也会与之结合发荧光，因此该方法并不能判断非特异性扩增。另外，SYBR Green 必须在 LAMP 反应完成后加入体系，其主要原因为 SYBR Green 与 DNA 具有较高的亲和力， 一旦结合则很难分离，会影响 Bst DNA 的链置换活性。

2.4比色检测（钙黄绿素检测法）

钙黄绿素是一种金属指示剂，在 LAMP 体系中加入锰离子和钙黄绿素，发现通过金属指示剂比色变化，可以监测 LAMP 反应的过程。但是添加钙黄绿素后，LAMP 的敏感性降低，其原因为钙黄绿素和双链 DNA 结合，影响了 Bst DNA 酶的链置换活性。

2.4比色检测（羟基萘酚蓝检测法）

羟基萘酚蓝(hydroxy-naphthol blue，HNB)也是一种金属指示剂，阳性管呈天蓝色，阴性管呈淡紫色。HNB 染料需现配现用并在反应前加入体系，避免开盖造成气溶胶污染。HNB 染料不易保存，且在实际操作时，每个操作者对于颜色的判定不尽相同，在一定程度上具有主观性。除此以外，HNB 染色法并不能区别体系中产生的引物二聚体或者非特异性扩增，可能导致假阳性结果。

基于 LAMP 的微流控技术在病原体检测方面的应用

病原体的快速准确检测对流行病学分析和感染性疾病早期防控具有重要意义。基于 LAMP 的微流控技术为病原体即时检验提供了一种快速诊断方法，尤其适合于基层实验室、灾区救治、感染事件现场等极端条件下病原体的快速筛查和现场检测。

3.1在呼吸道病原体监测中的应用

呼吸道病原体感染是呼吸系统的常见病，季节交替时更易发生，特别是流行性感冒病毒的易感人群，可能引起流行性感冒的爆发，基于LAMP 的微流控技术特别适合于临床病原体的快速诊断。赵溜[3]对呼吸道感染痰标本分别进行普通痰培养和常见呼吸道病原体的扩增分析（利用晶芯等温扩增技术)，结果显示，晶芯呼吸道病原体检测较传统痰培养的阳性率高，肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌和结核分枝杆菌复合群的病原体检出结果一致，但肺炎链球菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的检出率明显高于传统痰培养，有助于减少漏检，对疾病进行更早的诊断和治疗。

3.2在HIV检测中的应用

目前，尚无治疗HIV 感染所致获得性免疫缺陷综合征的有效手段，仅可通过药物缓解发病或控制症状，故HIV 感染的早期诊断有助于患者早期治疗。Damhorst 等[4]使用微流控和硅芯片平台对最小处理的 HIV 加标全血样本进行逆转录 LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，并使用普通智能手机进行荧光测量，结果显示，在60 nl RT-LAMP液滴中，只有3种病毒扩增，相当于每微升全血中 670 种病毒的全血浓度，表明可通过手指穿刺血液确定 HIV 阳性个体的病毒载量。

3.3在结核分枝杆菌检测中的应用

结核病亦称 “痨病”，是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。近年来，受到流动人口增加、耐药结核分枝杆菌蔓延、结核分枝杆菌与 HIV 双重感染等客观的影响，结核病的发病率和病死率升高。方雪恩[5]结合微流控芯片技术和 LAMP 建立了单个和多重定性定量的微流控集成芯片，整合基因的提取、扩增以及信号检测，仅需要微量的原始样品，即可在 45 ～60 min 内直接通过裸眼判定结核分枝杆菌。

3.4在脑膜炎奈瑟菌检测中的应用

脑膜炎奈瑟菌通过呼吸道传播，是引发流行性脑膜炎的唯一病原菌。预防脑膜炎奈瑟菌感染的关键是尽早清除传染源、早期诊断和治疗，切断传播途径。Dou 等[6]自主研发的基于 LAMP 的聚二甲基硅氧烷/纸混合微流控芯片可实现对脑膜炎奈瑟菌的检测，最低检出限仅为 3 拷贝/LAMP 反应区，灵敏度高。

3.5在乙型肝炎病毒检测中的应用

HBV感染是人类健康的世界性公共卫生问题之一。在 HBV 诊疗过程中，尽早发现早期低病毒血症患者、将诊疗关口前移、及时干预，是目前临床关注的问题。王可可等[7]利用基于 PCR 的微流控芯片成功完成了 HBV 核酸的快速检测，Ct 值约为37 时，检测结果为弱阳性，血液样本检出微量 HBV， 可早期发现 HBV 感染。

3.6在新型冠状病毒检测中的应用

新型冠状病毒肺炎( coronavirus disease 2019，COVID-19) 的高效、 准确、快速实验室检测是阻止疫情发展、确保患者尽早治疗的关键环节。2020 年11 月 17 日，美国食品药 品管理局紧急发布使用授权，批准Lucira COVID-19 一体化测试盒作为“新型冠状病毒居家自检测试剂盒”，该试剂盒利用 RT-LAMP 技术检测 SARS-CoV-2 的 N 基因RNA，通过微流控装置中光学和电子元件实时检测反应混合物的颜色变化，30 min 内实现新型冠状病毒的快速诊断; 采用罗氏 COBA S-CoV-2 试验对 101 名怀疑有症状受试者的鼻拭子样本进行差异分析，Lucira COVID-19 一体化测试试剂盒与美国食品药品管理局授权的高灵敏度分子 SARS-CoV-2 分析的阳性符合率为 94.1% ( 48 /51) ，阴性符合率为 98% ( 49 /50) ，体现了 Lucira COVID-19 一体化测试试剂盒的良好检测性能[8]。NSF International 和 Novateur Ventures 的研究人员在筛选了 1100 多个独立评估 COVID-19 的即时检测测试后，推荐基于 RT-LAMP 原理的 Seasun Biomaterials AQ-TOP Plus COVID-19 Rapid Test 用于新型冠状病毒急性感染的病毒 RNA 检测[9]。

总而言之，基于 LAMP 微流控芯片的检测速度快、灵敏度高、特异性强，适用于即时检验[10]， 特别适用于不具备病原体培养条件、缺乏病原体检测设备及专业人员等情况下的病原体快速检测，如现场野外、灾区救治、基层医疗机构，既可降低成本，又可实现高质量的快速诊断，在病原体感染所致重大疾病的防控及公共卫生事件的处置中均有非常重要的现实意义[11]。

参考文献：

[1] MORI Y，KANDA H，NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）：recent progress in research and development［J］. Journal of Infection and Chemotherapy，2013，19(3）: 404-411.

[2] NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification ［J］. Nihon Rinsho，2007，65（5）：957-961.

[3] 赵溜． 晶芯呼吸道病原体核酸检测技术与痰培养在临床中的应用［J］． 实用检验医师杂志，2019，11( 3) : 162-164．

[4] Damhorst GL，Duarte-Guevara C，Chen W，et al． SmartphoneImaged HIV-1 Reverse-Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) on a Chip from Whole Blood[J］． Engineering ( Beijing) ，2015，1( 3) : 324-335．

[5] 方雪恩． 微流控 LAMP 芯片的研究及在生物分子床边快速检测中的应用［D］．上海: 复旦大学，2012．

[6] Dou M，Dominguez DC，Li X，et al． A versatile PDMS /paper hybrid microfluidic platform for sensitive infectious disease diagnosis［J］． Anal Chem，2014，86( 15) : 7978-7986．

[7] 王可可，杨柯，赵俊，等． 基于微流控芯片的荧光定量 PCR 法快速检测乙肝病毒核酸 [J］． 分析科学学报，2018，34 ( 4) : 450-454.

[8] Coronavirus ( COVID-19 ) Update: FDA Authorizes First COVID-19 Test for Self-Testing at Home[EB /OL］． ( 2020-11- 17) ［2020-11-30］．

[9] Ghaffari A，Meurant R，Ardakani A． COVID-19 Point-of-Care Diagnostics That Satisfy Global Target Product Profiles［J］． Diagnostics ( Basel) ，2021，11(1) : 115.

[10] 华文浩，盛琳君，王清涛． 感染性疾病诊断中 POCT 应用的进展［J］． 中华检验医学杂志，2019，42( 5) : 333-337．

[11] 欧红玲，王绮远，王岩，等. 基于环介导等温扩增的微流控技术在病原体检测中的发展与应用［J］．检测医学，2022，28（3）：591-595.

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