今天给大家介绍一篇在2020年六月发表于cell上的一篇关于脑胶质瘤的文章，Interrogation of the Microenviromental Landscape in Brain Tumors Reveals Disease-Specific Alterations of Immune Cells。
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图中间出穿黑色衣服的女性是这篇文章的通讯作者。 Joyce 实验室位于 UNIL/CHUV 肿瘤学系，也是瑞士莱曼癌症中心 (SCCL) 内路德维希癌症研究所的一部分。
In Brief：
这篇文章利用高纬度，多组学的方法描述了脑瘤的肿瘤微环境，包括脑胶质瘤和脑转移瘤的比较。 研究结果显示：肿瘤微环境中免疫细胞的类型依赖于肿瘤的起源，以及IDH这个基因的状态。
Highlights：
1 流式，RNA seq, 蛋白质以及成像分析揭示了脑部的肿瘤微环境的复杂。
2 脑胶质瘤的IDH突变状态以及脑转移的原发肿瘤共同塑造了脑部的肿瘤微环境。
3 小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞表现出多方面的激活
4 肿瘤微环境细胞显示出疾病和细胞类型特异的表达模式。
Abstract
脑的肿瘤包含有原发灶和转移灶，包括低级和高级脑胶质瘤和来自其他颅外器官的脑部的转移。 目前人们对于脑部肿瘤微环境的理解还是十分有限，并且不知道原发性肿瘤和转移性肿瘤对TME是否有不同的影响。于是，在这篇文章中，他们通过流式细胞仪，RNA测序，蛋白质组学，培养和空间组织 去分析了脑部的肿瘤微环境。 此项研究揭示了免疫细胞的疾病特异性富集，在组织驻留的小胶质细胞、浸润的单核细胞衍生的巨噬细胞、中性粒细胞和 T 细胞的比例丰度方面存在显着差异。这些综合分析还揭示了脑恶性肿瘤中的多方面免疫细胞激活，揭示了脑恶性肿瘤具有保守的转录组轨迹的同时，也有疾病或者细胞类型特异的程序。 考虑到大家对发展脑癌肿瘤微环境靶向治疗的兴趣，本研究对于脑癌的免疫治疗提供了理论基础。
Introduction
脑恶性肿瘤包括脑内出现的肿瘤，例如低级别胶质瘤和胶质母细胞瘤，以及源自颅外原发性肿瘤的脑转移瘤（BrMs）：颅外原发性肿瘤：包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。代谢酶异柠檬酸脱氢酶 1 和 2 ( IDH mut) 的胶质瘤突变体通常是低级别 (II 或 III) 并且比IDH野生型 (WT) 肿瘤具有明显更好的预后，后者通常是 IV 级胶质母细胞瘤。尽管标准的护理治疗包括手术后放疗和替莫唑胺，胶质母细胞瘤患者的中位生存率仍然很低。BrM 诊断后的患者存活率可能更低，通常以月为单位衡量，并且在所有成人脑肿瘤中，BrMs 的发病率明显超过胶质瘤。
鉴于目前这些患者的治疗选择有限，需要解决的一个关键问题是，深入全面了解原发性和转移性癌症如何在脑肿瘤微环境 (TME) 中发展是否可以揭示治疗干预的有希望的新靶点。尽管多种 TME 细胞类型可以在广泛的颅外肿瘤中严格调节癌症进展和对治疗的反应。鉴于其独特的细胞类型，包括星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞 (MG)，我们不能简单地将这些癌症的发现外推到单一的脑 TME；该器官的免疫抑制环境；以及细胞和药物通过血脑屏障 (BBB) 所面临的挑战。
免疫检查点阻断 (ICB)、过继细胞疗法和疫苗代表了针对 TME 内和全身性免疫细胞的治疗方法。免疫疗法在某些颅外癌症中的成功为它们在脑恶性肿瘤中的评估提供了明确的动机。然而，尽管它们在部分 BrM 患者中显示出一些临床疗效。
迄今为止，ICB 仅对孤立的原发性胶质瘤病例产生了反应。除了肿瘤细胞内在效应之外，这可能部分归因于脑 TME 的免疫抑制成分，包括肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)，它们已成为脑癌的主要参与者。在小鼠中进行的谱系追踪实验表明，脑 TAM 可以来源于组织驻留的 巨噬细胞（MG） 或从外周循环募集的单核细胞衍生的巨噬细胞 (MDM)。TAM 是高度可塑性的细胞，整合了来自细胞因子、生长因子和其他刺激的输入，导致不同的激活状态和细胞表型，包括促进侵袭、血管生成、转移和免疫抑制。这种可塑性及其在恶性细胞和肿瘤浸润性 T 细胞之间的关系使 TAM 成为不同癌症中 TME 导向疗法的有希望的靶点。事实上，对小鼠的研究表明，TAMs 的表型改变导致胶质母细胞瘤的抗肿瘤功效，而 TAM 耗尽会阻止 BrM 生长。
尽管有这些临床前研究，但两种个体遗传学上不同的 TAM 细胞类型在人脑恶性肿瘤中的确切贡献尚不清楚，这阻碍了临床转化。例如，先前关于 TAM 在患者脑肿瘤中的作用的研究并未基于谱系追踪衍生标记的使用区分 MG 和 MDM。或仅关注神经胶质瘤。因此，我们研究了胶质瘤和 BrM 中的 TME ，重点是探索 TAM，同时还研究了它们与 TME 中其他免疫细胞和结构的关系。我们利用这种多模式资源来解决许多问题。大脑内产生的肿瘤形成的 TME 与从颅外部位转移的癌症是否不同？IDH突变状态会影响 TME 吗？不同的 TME 成分如何潜在地调节免疫细胞的激活状态？通过整合这些问题的答案，我们提供了关于利用大脑 TME 对抗这些致命疾病的潜在策略的见解。
Tumor Origin and IDH Mutational Status Influence the Immune Composition of Brain Malignancies
肿瘤起源和IDH突变状态影响脑恶性肿瘤的免疫成分
我们首先通过全组织切片的免疫荧光 (IF) 染色和非肿瘤脑组织IDH* mut 低级别的流式细胞术 (FCM) 分析分析泛白细胞标记 CD45，确定脑 TME 中广泛的免疫细胞丰度和IDH WT 高级别胶质瘤，以及源自不同原发性的 BrM，包括乳腺癌、肺癌和黑色素瘤（图1A、1B和S1A）。这表明癌症样本中的白细胞丰度约为 20%–40%。将 CD45 +细胞分层为髓系和淋巴系显示IDH mut 和IDH WT 神经胶质瘤中的髓系细胞显着增加，而在BrM原发肿瘤 与非肿瘤组织相比没有相差太多（图 1 B；p < 0.05，单侧学生 t 检验）。我们使用多色荧光激活细胞分选 (FACS) 分析了 100 个临床样本中的 14 个主要免疫细胞群（图 S1 A；表 S1和S2），并收集了来自 48 名患者的细胞用于 RNA 测序（RNA-seq）（表 S3；完整的临床注释）
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通过结合高级胶质瘤和 BrM 的细胞谱系追踪和小鼠模型，我们之前确定了细胞表面标志物整合素 alpha 4，ITGA4/CD49D，作为区分肿瘤相关 MG (T-MG) 和肿瘤相关 MDM 的一种手段(T-MDM) ，我们将其整合到临床样本分析中。这使得能够对 CD45 -非免疫细胞、CD49D低MG、CD49D高MDM、中性粒细胞以及 CD4 +和 CD8 + T 细胞进行分类（图 S1 A；表 S2。FCM 标记和免疫细胞定义，与图 1 和 S1 相关,表 S3.用于 RNA-seq 转录组分析的 RNA-Seq 分析和蛋白质阵列分析 A) 中包括的患者的临床特征（肿瘤类型、等级、组织学、IDH 状态和以前的治疗方法） 。我们通过对排序的 CD49D低和 CD49D高的 FCM 重新分析来评估排序保真度TAM 群体（纯度，98.4%–99.8%）并通过研究来自 CD45 -细胞和 CD49D低和 CD49D高TAM 群体的 RNA-seq 读数中典型IDH密码子 132 错义突变的频率。*尽管我们观察到来自IDH mut 神经胶质瘤的 CD45 *-细胞中的平均突变等位基因频率为 0.43 （范围，0.3-0.61），但这在 TAM 中非常罕见（平均值，0.01；范围，0.0-0.09），表明细胞群的可靠分离. 在排序种群的 t 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 可视化中，样本主要按细胞类型聚类（图 S1 B），胶质瘤和 BrM 在 CD45 中可作为单独的组识别-人口。
在其他主要脑 TME 成分背景下的全局表达分析中，CD49D低和 CD49D高TAM 群体紧密聚集，表明广泛的转录组相似性。因此，我们通过分析先前从谱系追踪研究中确定的 MG 和 MDM 特异性个体发育核心基因组的关联，进一步询问 CD49D 区分 TAM 种群的效用，在从非恶性和脑癌组织中分选出来的人类 CD49D低和 CD49D高细胞中。这揭示了相应细胞类型中个体发育核心基因集的富集（图1C），证明了我们能够准确区分人类样本中不同疾病实体的 MG 和 MDM。有趣的是，这些核心特征在某些肿瘤类型中受到影响，T-MDM 在IDH mut 神经胶质瘤中显示出增加的 MG 核心基因组信号，而 T-MG 在 BrM 中获得 MDM 特征，表明这些细胞的组织依赖性转录编程，进一步下面审问。
接下来，我们使用聚类分析评估了肿瘤内免疫细胞群的分布情况（图 S1 A；表 S2），以确定细胞丰度的模式（图 1 D；独立性卡方检验，p < 0.0001）。这揭示了三个主要集群：（1）非肿瘤样本和IDH mut 胶质瘤，其特征是 MG 占优势，其他免疫细胞数量较少；(2) IDH WT 胶质瘤和几个 BrMs 涌入 MDMs，在一定程度上，中性粒细胞进入肿瘤，但主要排除淋巴细胞；(3) 主要是 BrM 和少数IDHWT 神经胶质瘤表现出最多样化的免疫细胞景观，T 细胞和中性粒细胞大量浸润。某些肿瘤含有 CD14低/CD16 +非经典单核细胞、CD14 + /CD16 +中间单核细胞、CD16 -粒细胞、树突状细胞 (DC) 或未成熟的骨髓细胞。在所有样本中，淋巴细胞室主要由 T 细胞组成，自然杀伤 (NK) 细胞和 B 细胞较少。
所有被调查群体的相对丰度的主成分分析 (PCA) 证实，MG、MDM、中性粒细胞以及 CD4 +和 CD8 + T 细胞是大脑 TME 格局的主要免疫细胞决定因素（图 1 E）。主成分 1 (PC1) 将非肿瘤组织和IDH mut 胶质瘤与IDH WT 胶质瘤和 BrM 区分开来，而 PC2 区分IDH WT 胶质瘤和 BrM。对胶质瘤中IDH状态和 BrM 中的原发肿瘤部位进行分层的进一步分析证实，BrM 中淋巴细胞的比例明显更高（图 1 F；平均淋巴细胞 %CD45 + = 46.23%，SEM = 4.15，t 检验，p < 0.0001）。黑色素瘤 BrM 表现出最丰富的淋巴细胞浸润，具有相当大的 CD8 + T 细胞分数（平均CD8 + %CD45 + = 33.01%，SEM = 5.82，单向方差分析，p < 0.01）。在某些 BrM 中检测到调节性 T 细胞 (Tregs)（平均Treg %CD45 + = 1.2%，SEM = 0.36），但在胶质瘤中很少见（平均Treg %CD45 + = 0.25 %，SEM = 0.05，t 检验，p < 0.05 ）。
由于 T-MG 和 T-MDM 在脑恶性肿瘤的骨髓腔中的突出地位，我们使用 IF 染色和反卷积分析来独立验证它们的存在。常用的 MG 标记，如P2RY12、TMEM119和SALL1，以及 MDM 相关基因，如AHR和VDR，在不同脑恶性肿瘤中显示出不同的 RNA 表达水平，同时以类似的方式保持其细胞类型特异性（图 S2 A）正如对个体发育核心基因组所观察到的那样（图1C ）。在蛋白质水平上观察到了相同的模式（图 S2B)，其中 P2RY12 在非肿瘤组织中表达最高，CD68 在 BrM-TAM 群体中最丰富。这需要使用由 CD49D 补充的两种标记，以在 IF 分析中可靠地识别 MG 和 MDM（图 S2 C）。我们使用这种策略通过全切片量化来询问一组非肿瘤、神经胶质瘤和 BrM 样本，确认IDH WT 神经胶质瘤和 BrM 中的 MDM 积累（图2A -2C）。此外，对来自相同个体样本的 IF 和 FCM 独立处理的组织进行比较显示出显着的一致性（图 S2 D）。
我们在分选的细胞群中查询 T-MG 和 T-MDM 特异性差异表达基因 (DEG)，将这两个群与最丰富的其他细胞类型分开；即，CD45 -细胞、中性粒细胞和 T 细胞（图 S2 E）。在 T-MG 中高度表达的几个基因是公认的 MG 标记（P2RY12、TMEM119和TAL1），而在 T-MDM 中高度表达的基因包括替代巨噬细胞极化标记（FCGR2B和CLEC10A）和 DC 样表型（CD1C、CD1B和CD207）具有增强的吞噬和抗原交叉呈递能力（CD209 )。这些基因集还允许我们利用公开可用的集成数据集包含来自基因型组织表达项目 (GTEx;) 的健康皮质脑组织的大量表达数据。 以及来自癌症基因组图谱 (TCGA);在大量组织转录组去卷积方法中。在该外部数据集（n = 711 个样本）中获得的 MG 和 MDM 比例估计值证实了IDH mut 神经胶质瘤中 MG 的患病率和IDH WT 神经胶质瘤中的 MDM 富集（图2D）。
MG and MDMs Exhibit a Multifaceted Polarization Phenotype in Brain Malignancies
MG 和 MDM 在脑恶性肿瘤中表现出多方面的极化表型
我们接下来使用 PCA 专门关注 TAM 并分析其表达受组织类型（即参考 MDM、非肿瘤脑、胶质瘤和 BrM）和细胞类型（即 MG 和 MDM）影响的基因（图 3A） . 在前两台 PC 中，MG 和 MDM 投射到不同的空间，体外分化的 MDM 与组织来源的样本不同。我们观察到 PC1 的梯度，一端为非肿瘤脑组织，穿过IDH mut 和IDH WT 神经胶质瘤，并以 BrMs 结束。因此，TAM 转录组变化受大脑 TME 本身以及特定类型的恶性肿瘤的影响。
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我们分别将来自 BrM 或神经胶质瘤（无论IDH突变状态）的 T-MG 和 T-MDM 与来自非肿瘤脑或来自健康供体的体外分化的 MDM 的 MG 进行了对比。这揭示了两个群体中的深刻表达变化，与 T-MG 相比，T-MDM 在其转录反应中表现出更高的幅度（图 S3 A）。胶质瘤和 BrM 中 DEG 的交叉点在 T-MDM 中最高（图 S3B），可能反映了这些细胞在进入脑肿瘤的完全外来环境时所经历的更大变化。当关注 T-MG 或 T-MDM 独有的胶质瘤和 BrM 中上调的基因时，这一点也很明显（图3B）。在 T-MG 和 T-MDMs 中，不同疾病的共享基因数量高于同一肿瘤类型中这两个细胞群之间的共享基因数量。因此，在所有疾病和 TAM 类型的比较中，只有少数基因 (n = 137) 显示出一致的上调（图 3 B）。
为了探索神经胶质瘤和 BrMs 中保守的潜在生物学过程，我们使用基因集过度表示分析 (ORA) 检查了 T-MG 或 T-MDMs 中上调基因的交叉 (图 S3 B)。在分子特征数据库 (MSigDB) 主要生物学类别的“标志性”集合，T-MG 和 T-MDM 在 (1) TME 建模（“血管生成”、“缺氧”）、(2) 炎症（“炎症反应”、“同种异体移植物”排斥”）和（3）免疫细胞激活状态（“TNF⍺ 通过 NFκB 信号传导”、“干扰素 ⍺ 反应”、“干扰素 γ 反应”、“IL2 STAT5 信号传导”和“IL6 JAK STAT3 信号传导”）（[图 S3]保守。(https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30569-9?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420305699%3Fshowall%3Dtrue#figs3) C）。
我们还使用一组标记基因评估了 T-MG 和 T-MDM 的 M1 和 M2 极化状态。然而，在胶质瘤或 BrM T-MG 或 T-MDM 中没有出现明确的 M1 与 M2 表型的明显模式（图 S3 D）。为了进一步探索 T-MG 和 T-MDM 的激活状态，我们将它们各自上调的基因置于巨噬细胞刺激特异性程序的 ORA 中。这揭示了包含典型 M1（干扰素 γ [IFNγ]）和 M2 极化（白细胞介素 4 [IL-4]）的多方面反应（图 3 C），包括与慢性炎症刺激相关的表达变化（肿瘤坏死因子 α [TNF- ⍺] + 前列腺素 E [PGE 2 ] 和 TNF⍺ + PGE 2 + Pam3CysSerLys4 [TPP]）和接触游离脂肪酸（油酸 [OA] 和棕榈酸 [PA]），这与调节骨髓细胞功能有关。这表明 T-MG 和 T-MDMs 在胶质瘤和 BrMs 中的不同转录编程超出了简单的 M1 与 M2 极化。
为了了解哪些过程与这些反应相关并可能驱动这些反应，我们确定了基因集富集分析（GSEA) 胶质瘤和 BrM 中的 T-MG 和 T-MDM 中的前沿基因，并将它们聚集成具有非负矩阵分解的前沿元基因 (LEM) 。这确定了每种细胞类型多达 5 个不同的 LEM，并进行了比较，它们以成对的方式进行了显着重叠测试（图 S3 E），并使用基因本体论（GO）术语进行了注释（图3D）。与有丝分裂和细胞增殖相关的 LEM 存在于胶质瘤和 BrM 的 T-MG 和 T-MDM 中（图 3 D，第 1 组）。这些 LEM 的生物学有效性通过在非肿瘤、神经胶质瘤和 BrM 组织切片中染色 Ki-67（一种细胞增殖标志物）来验证（图 3 E），显示 T-MG 和 T-MDM 中的增殖增加IDH WT 胶质瘤和 BrM 以及IDH mut 胶质瘤中的 T-MG。
有趣的是，在胶质瘤和 BrM T-MDM 和 BrM T-MG 中检测到富含 I 型 IFN 信号传导的 LEM，但在胶质瘤 T-MG 中未检测到（图3D，第 2 组）。持续的 I 型 IFN 信号传导与介导免疫抑制和 ICB 抗性有关。这些第 2 组 LEM 的严格性通过建立共享 LEM 基因的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络得到验证（图 S3 F）。除了它们在抗病毒反应中的作用之外，PPI 网络中心突出显示的基因（图 S3 F，红色节点）还涉及多种肿瘤促进和抑制作用。类似地，更多的外围网络节点IL15和TNFSF10可能分别能够调节有效的免疫抗肿瘤反应或诱导癌细胞凋亡。我们询问这些基因是否直接由脑 TME 中的分泌因子诱导，并建立了基于细胞的试验，以将 MDM 暴露于由新鲜分离的神经胶质瘤或培养中的 BrM 样本的单细胞悬浮液产生的 TME 条件培养基 (CM)。分析的所有基因都被 BrM-TME-CM 上调，神经胶质瘤 TME-CM 在较小程度上上调（图 3 F）。我们还在 BrM-MG、胶质瘤 MDM 和 BrM-MDM 中检测到炎症和核因子 κB (NFκB) 信号相关 LEM 的诱导（图 3D，第 3 组）。指向 Th17 反应（第 4 组）和免疫细胞募集以及不同免疫细胞区室之间相互作用的 LEM 仅在 MDM（第 5 组）中检测到。总的来说，这些分析揭示了 MG 和 MDM 在整合到脑恶性肿瘤 TME 后获得了多方面的激活状态。
IDH Mutation Status Associated with Changes in Glioma TAM Activation
IDH突变状态与胶质瘤 TAM 激活变化相关
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我们接下来询问 MG 和 MDM 是否占据IDH WT 神经胶质瘤 TME 内的不同区域。组织切片的空间分析显示血管周围生态位中两个种群的显着富集（图 4 A 和S4 A）。相对于 CD31 +血管结构的分布分析表明，与 T-MG 相比，T-MDM 更接近（图 4 B 和S4 A）。来自 Ivy Glioblastoma Atlas Project (Ivy GAP) 研究的解剖转录组数据的询问，还证明了微血管隔室中 T-MDM 的富集（图 S4 B）。这种富集与 CD4 +和 CD8 + T 细胞一致，表明IDH WT 神经胶质瘤中进一步的空间 TME 组织。
我们评估了不同的 T-MG 和 T-MDM 分布和细胞数量是否与它们的激活状态平行。在 LEM 分析中，我们在胶质瘤 MDM 中检测到 I 型 IFN 反应，但在 MG 中未检测到（图 3 D）；因此，我们查询 FCM 数据以分析主要组织相容性复合体 (MHC) II 类人类白细胞抗原-DR 同种型 (HLA-DR) 表达的水平。这表明与IDH mut 和IDH WT 肿瘤中的 T-MG 相比，T-MDM 中的 HLA-DR 显着增加（图4C ）。我们使用 GSEA 和基因集变异分析 (GSVA) 筛选了抗原加工和呈递途径基因集的相关 RNA-seq 数据（图 4D)。有趣的是，我们发现了在IDH WT 神经胶质瘤 MDM中 MHC II 类抗原呈递基因组以及抗原加工相关途径（图 S4 C）和 MHC I 类呈递基因组（图 4 D）中表达增加的证据。尽管这些发现表明 TAMs，尤其是 T-MDMs 具有启动免疫反应的潜力，但根据 ICB 在这种疾病中的试验的现状，这种潜力在胶质瘤 TME 中通常没有实现，因此我们询问是否存在这些细胞群中也存在促肿瘤状态的证据。
我们比较了来自IDH WT 神经胶质瘤的 T-MG 和 T-MDM 与来自IDH mut 神经胶质瘤的 T-MG，因为它们分别构成这些肿瘤中最丰富的 TME 细胞类型（图 1 F 和2 C；表 S5）。这揭示了 T-MG 中的 489 个 DEG（图 4 E；表 S5；406 个上调和 83 个下调），以及 T-MDM 中的 1,478 个（图 4 F；表 S5；903 个上调和 575 个下调）。尽管这些基因列表是通过比较来自IDH WT 神经胶质瘤的 T-MDM 与来自IDH mut 神经胶质瘤的 T-MG 生成的，但它们类似地将IDH mut 中的 T-MDM 与聚类分析中的IDH WT 疾病（图 4 F）表明它们确实反映了基于肿瘤IDH状态的 T-MDM 改变。421 个基因在两种 TAM 细胞类型中表现出相似的模式（343 个上调和 78 个下调），表明 T-MG 和 T-MDM 在IDH WT 肿瘤中也可以获得共同的转录模式。共享基因中有几种编码细胞外基质 (ECM) 蛋白（图 4 G、FN1 和VCAN）和 ECM 相关基质细胞蛋白（THBS1、TGFBI、LGALS3和ANGPTL4) 调节 ECM 隔离配体的可用性、血管生成和肿瘤免疫。这表明 TAM 有助于塑造IDH WT 肿瘤中 ECM 蛋白的组成和效应功能。我们还发现了抗炎分子ANXA1和GPNMB（图 4 G），它们以前与促肿瘤巨噬细胞极化和抑制 T 细胞活化有关，在 T-MG 和 T-MDM 中上调。
我们接下来研究了IDH WT 肿瘤 CD45 -群体中的炎症介质及其在 TAM 中的相应受体。与IDH mut CD45 - 细胞相比TGFB2表达升高，并且辅助转化生长因子 β (TGF-β) 受体ENG在IDH* WT TAM 中高度表达（图4H）。TGFB2 在伤口愈合过程中的炎症和组织重塑中具有多效性，并且与胶质母细胞瘤细胞中的自分泌信号环路有关。神经炎症细胞因子MDK可将 TAM 极化调节为胶质瘤中的 M2 样表型，在来自IDH* WT 肿瘤的 CD45 -细胞中上调，其受体SDC4和ITGA4/CD49D在 T-MDM 与 T-MG 中差异表达（图 4 H），表明这种推断的信号循环的细胞类型特异性效应。
我们询问从IDH WT 神经胶质瘤产生的 T-MDM 特异性基因集是否与患者的生存差异相关。通过逻辑回归，我们从脑恶性肿瘤中 TAM 中上调的基因总数（图3B）中得出了由 36 个基因组成的代表性特征（图 S4 D ）。这包括巨噬细胞标记RUNX3；非典型趋化因子受体ACKR3，可调节 CXCL12-CXCR4 信号；内质网 (ER) 应激蛋白HERPUD1和抑制性 Fc 受体FCGR2B，它们可以调节巨噬细胞的活化。; 以及影响血管生成和巨噬细胞极化的细胞因子IL19。该签名用于在低级别和高级别胶质瘤的合并 TCGA 数据集中对患者进行分类（图 4 I 和S4 E）。在IDH mut 患者中，中位总生存期的降低与 T-MDM IDH WT 特征的富集有关，而富集评分低的IDH WT 患者的生存期增加。这在多变量 Cox 比例风险模型中得到证实，该模型包括转录组神经胶质瘤亚型（如 TCGA 数据集中注释）和IDH状态（图 4J)。为了验证这种效应不仅仅反映了 T-MDM 数量的变化，我们根据用于去卷积的 T-MDM 特异性基因集的富集对 TCGA 队列进行了分类，这对存活率的影响很小（图 S4 F）。
鉴于迄今为止在胶质母细胞瘤中 PD1 或 PDL1 ICB 试验的结果令人失望，我们质疑丰富的 T-MG 和 T-MDM 是否会导致有限的治疗效果。我们对一组 20 个基因组进行了 ORA，这些基因组先前与先天性抗 PD1 抗性（IPRES；在IDH WT 神经胶质瘤的 TAM DEGs 中，发现相当大的部分在 T-MG 和 T-MDMs 中上调（图 S4 G）。然后，我们通过 GSVA 在单样本水平上包括 CD45 -群体和询问的 IPRES 基因集富集（图 S4 H）。这产生了不同程度的肿瘤细胞和 TAM 富含 IPRES 基因集的多样化图像。因此，来自IDH WT 神经胶质瘤的TAM 和 CD45 -细胞可能有助于介导先天 ICB 抗性。
The Immune Contexture Influences the TME on a Global Level
免疫环境在全局范围内影响 TME
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通过对蛋白质和基因表达数据的综合分析，我们接下来探讨了免疫细胞浸润的作用。在评估的 200 种炎症相关蛋白中，有 55 种在我们的样本队列中被差异检测（临床信息见表 S3 B）。无监督聚类分析揭示了肿瘤中具有丰富炎症蛋白的不同聚类（图 5A）。IDH WT 神经胶质瘤和 BrM 的特征显示出相当大的重叠（蛋白质簇 1），包括血管生成因子（VEGFA 和 ANG）、生长因子（PDGFA、TGFB1、SPP1 和 GDF15）、几种蛋白酶和蛋白酶抑制剂（SERPINE1、CTSS、和 TIMP1)、蛋白水解级联调节剂 PLAUR 和细胞因子 CCL2 和 CCL5 (图 5A和S5 A)。然而，我们还发现了神经胶质瘤和 BrM 之间不同的蛋白质模式。神经营养生长因子 FGF2 和神经元细胞粘附分子，包括 ALCAM，在神经炎症过程中调节免疫细胞浸润，在非肿瘤脑、IDH mut 和IDH WT 样本中高度表达（蛋白质簇 3；图 S5 A）。相反，BrM 样本含有丰富的免疫调节分子，影响骨髓和淋巴细胞及其异型信号传导（蛋白质簇 2；图 S5 A），例如 CD40L、IL6R、INHBA 和 AREG)，可能反映了 BrM 中更大的免疫细胞多样性。这个正交数据集强化了 RNA-seq 分析，表明炎症信号通路在脑肿瘤中高度富集。
我们整合了细胞类型特异性 RNA-seq 数据和大量蛋白质数据，以区分表达更受限的蛋白质与在一系列细胞类型中表达的蛋白质。使用自组织图 (SOM) 对来自所有肿瘤样品的CD45 -细胞、TAM、中性粒细胞和 CD4 +和 CD8 + T 细胞的转录组数据进行聚类。这产生了 6 个 SOM 点（即共表达基因的元基因；图 5 B），概括了各自的细胞谱系（图 S5 B）。CD45 -种群被分配到与更具侵略性的IDH相关的三个不同的点WT 神经胶质瘤和 BrM（点 VI）或反映脑内或外源性肿瘤起源（点 I 和 V）。这些细胞类型相关的 SOM 点与蛋白质数据有很大重叠（55 种蛋白质中的 30 种，Fisher 精确检验，p < 0.0001；图 5 C）。虽然VEGFA、ANG和TGFB1在胶质瘤和 BrM 中的不同细胞类型中表达，但其他基因，如GDF15和IGFBP2，表现出更多的 CD45 -细胞限制性表达（图 5 D）。TAM 对关键炎症蛋白（包括SPP1和IHNBA ）产生的重大贡献，由 TAM SOM 斑点 III 反映，构成具有细胞类型特异性表达的最大蛋白质组（图 5 C 和 5D）
Myeloid Cells Show a Distinct Phenotype in BrMs
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通过对蛋白质和基因表达数据的综合分析，我们接下来探讨了免疫细胞浸润的作用。在评估的 200 种炎症相关蛋白中，有 55 种在我们的样本队列中被差异检测（临床信息见表 S3 B）。无监督聚类分析揭示了肿瘤中具有丰富炎症蛋白的不同聚类（图 5A）。IDH WT 神经胶质瘤和 BrM 的特征显示出相当大的重叠（蛋白质簇 1），包括血管生成因子（VEGFA 和 ANG）、生长因子（PDGFA、TGFB1、SPP1 和 GDF15）、几种蛋白酶和蛋白酶抑制剂（SERPINE1、CTSS、和 TIMP1)、蛋白水解级联调节剂 PLAUR 和细胞因子 CCL2 和 CCL5 (图 5A和S5 A)。然而，我们还发现了神经胶质瘤和 BrM 之间不同的蛋白质模式。神经营养生长因子 FGF2 和神经元细胞粘附分子，包括 ALCAM，在神经炎症过程中调节免疫细胞浸润，在非肿瘤脑、IDH mut 和IDH WT 样本中高度表达（蛋白质簇 3；图 S5 A）。相反，BrM 样本含有丰富的免疫调节分子，影响骨髓和淋巴细胞及其异型信号传导（蛋白质簇 2；图 S5 A），例如 CD40L、IL6R、INHBA 和 AREG，可能反映了 BrM 中更大的免疫细胞多样性。这个正交数据集强化了 RNA-seq 分析，表明炎症信号通路在脑肿瘤中高度富集。
我们整合了细胞类型特异性 RNA-seq 数据和大量蛋白质数据，以区分表达更受限的蛋白质与在一系列细胞类型中表达的蛋白质。使用自组织图 (SOM) 对来自所有肿瘤样品的CD45 -细胞、TAM、中性粒细胞和 CD4 +和 CD8 + T 细胞的转录组数据进行聚类。这产生了 6 个 SOM 点（即共表达基因的元基因；图 5 B），概括了各自的细胞谱系（图 S5 B）。CD45 -种群被分配到与更具侵略性的IDH相关的三个不同的点WT 神经胶质瘤和 BrM（点 VI）或反映脑内或外源性肿瘤起源（点 I 和 V）。这些细胞类型相关的 SOM 点与蛋白质数据有很大重叠（55 种蛋白质中的 30 种，Fisher 精确检验，p < 0.0001；图 5 C）。虽然VEGFA、ANG和TGFB1在胶质瘤和 BrM 中的不同细胞类型中表达，但其他基因，如GDF15和IGFBP2，表现出更多的 CD45 -细胞限制性表达（图 5 D）。TAM 对关键炎症蛋白（包括SPP1和IHNBA ）产生的重大贡献，由 TAM SOM 斑点 III 反映，构成具有细胞类型特异性表达的最大蛋白质组（图 5 C 和 5D）。
Myeloid Cells Show a Distinct Phenotype in BrMs
髓系细胞在 BrM 中表现出不同的表型
我们将胶质瘤中 TAMs 的表达模式（无论IDH状态如何）与 BrMs 并列的全球分析显示了疾病和细胞类型特异性的转录组变化。因此，我们通过关注仅与相应参考和IDH WT 神经胶质瘤相关的基因上调来探索 BrM 特异性改变（图 S6 A 和 S6B；表 S6）。各种细胞因子、趋化因子和促炎分子在 BrM-MG 和 BrM-MDM 中升高（图 6A），包括自身免疫性神经炎症的强效介质CSF2和IL23A（图 6A）和模式识别受体MARCO。有趣的是，颅外肿瘤中抗体介导的 MARCO 靶向增加了 TAM 的 M1 样极化并增强了 ICB 疗效。这些效应依赖于抗体与FCGR2B的相互作用，这也是 T-MDM IDH WT 特征的一部分（图 S2 E 和S4 C）。最后，RETN，它与全身炎症性疾病有关，在 BrM-TAM 中上调
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对单个 BrM-TAM 群体的分析揭示了不同的表达模式。BrM-MG 表现出限制性的IL6上调（图 6A），它对癌症中的 T 细胞功能发挥免疫抑制作用并介导 ICB 抗性和受体TREM1，它在神经炎症期间调节 MG 和全身性骨髓细胞的促炎反应。在上调的趋化因子中，我们发现 TAM 细胞类型（CCL23）和 BrM-MG 限制性（CXCL5和CXCL8）或 BrM-MDM 限制性增加（CCL8、CCL13、CCL17和CCL18*）均增加（图 6A）。这些结果揭示了 TAM 群体以疾病特异性方式对炎症性 TME 环境的不同贡献。
GSEA 确定了额外的细胞类型特异性富集模式。BrM-MG 显示出 IL-6 通路活性的证据（图 S6 C），并且在 BrM-MDM 中，“Naba 核心基质体”基因组显着富集（图 S6 D）。这促使我们评估了 BrM-MDM 与 BrM-MG 中编码 ECM 和基质细胞蛋白的基因的表达，这揭示了编码基质蛋白的基因，包括 III 型和 IV 型胶原蛋白FN1蛋白聚糖LUM和OGN以及基质细胞蛋白ECM1 SPARC和SPARCL1在 BrM-MDM 中高度表达（图 6乙）。尽管 ECM 重塑与肿瘤进展有关，但LUM、OGN、SPARCL和SPARCL1表现出促进和抗转移的特性，这强调了 ECM 复杂的环境依赖性作用。我们还发现组织蛋白酶CTSB和CTSW在 BrM-MDM 中高表达（图6B ），它们参与多种肿瘤促进过程，包括侵袭和转移。透明质酸受体HMMR，参与肺损伤中的巨噬细胞趋化和纤维化，在 BrM-MDM 中也更高（图 6 B）。总之，这些数据表明 ECM 不仅由原发部位的巨噬细胞形成，但 T-MDM 也可能在 BrM 中的 ECM 生态位构建中发挥关键作用，这与IDH WT 神经胶质瘤不同（图 4 G）。
鉴于CXCL8（一种关键的中性粒细胞趋化剂）被 BrM-MG 上调（图 6A），我们探讨了 TME 对中性粒细胞募集的贡献，这些中性粒细胞在 BrM 中非常丰富（图1F）。对主要中性粒细胞募集趋化因子及其受体的分析显示，在所有被询问的骨髓细胞中广泛表达（图 S6 E）。为了探索与 BrM 相关的中性粒细胞的表型，我们查询了 RNA-seq 数据，结果显示 BrM 特异性上调ITGA3（图 6 C），其参与败血症中的中性粒细胞组织浸润，以及CXCL17，先前与中性粒细胞和巨噬细胞在癌症中的募集。我们还观察到腺苷受体ADORA2A的上调（图 6 C），它减弱了促炎中性粒细胞的表型。此外，我们发现CD177的表达增加（图 6 C），这是一种调节中性粒细胞迁移和活化的细胞表面受体，可作为 PR3 阳性中性粒细胞的标志物，进而对 T 细胞增殖产生负面影响。值得注意的是，MET与癌症中免疫抑制性中性粒细胞的募集有关，在中性粒细胞中以 BrM 特异性方式上调（图6C ）。总之，我们发现了骨髓细胞的多种疾病特异性改变，从 BrM-TAM 延伸到中性粒细胞，这对 TME 内其他细胞类型（包括 T 细胞）的募集和激活具有潜在意义。
TAMs Are Poised toward an Immunomodulatory Phenotype in BrMs
TAM 有望在 BrM 中形成免疫调节表型
尽管我们通过 FCM发现 BrM 与IDH WT 胶质瘤中 CD4 +和 CD8 + T 细胞的显着积累，但这种对分离组织样本的分析缺乏结构信息。因此，我们对 IF 表型IDH WT 和 BrM 组织切片进行了邻域分析，以阐明 TAM 和 BrM 中的 CD3 + T 细胞之间是否存在空间关系。在IDH WT 神经胶质瘤中，T-MG 和 T-MDM 大多与同型细胞相邻，而在其附近缺乏 T 细胞（图 7A、7B 和S7A），可能反映了这些肿瘤中普遍的 T 细胞稀疏性。相比之下，两个 TAM 群体在 BrM 中更频繁地与 T 细胞相邻，表明存在相互作用的可能性（图 7 A、7B 和S7 A）。因此，我们研究了 BrM 中的 T 细胞活化状态与无与伦比的健康供体血液的关系，并将它们与IDH WT 神经胶质瘤的相应群体并列。与对照组相比，来自 BrM 的CD4 + T 细胞表现出低反应性、无反应性表型的证据（图 7 C），而 CD8 + T 细胞表现出衰竭特征（图 7 D），这通常发生在慢性激活时，导致上调抑制性受体。这些有缺陷的 T 细胞状态可能是由 TME 中的肿瘤细胞和抗原呈递细胞的异常激活或 T 细胞抑制引起的，并且是治疗癌症的主要障碍。
为了描述 BrM TME 中可能驱动这些改变的推定机制，我们探测了来自 CD45 -细胞、TAM 和 T 细胞（图 7 E）的 RNA-seq 数据，以了解激活和抑制性免疫调节信号的表达。这揭示了各种典型 T 细胞激活剂和共激活剂的上调，以及 T 细胞中的抑制介质（PDCD1 / PD1、CD28和CTLA4），而在两个 TAM 群体（CD274 / PD ）中检测到 T 细胞抑制和激活信号-L1和PDCD1LG 2/ PD-L2 )。值得注意的是，我们发现CD80上调，它在 T 细胞活化中具有多种作用，因为它与 CD274 异二聚化，通过 CD28 向 T 细胞提供共刺激信号，并通过与 CTLA4 相互作用发挥抑制作用，在两个 TAM 群体中与其正常参考和IDH WT 肿瘤群体相比（图 7 E）。IDO1和IDO2的高表达也表明 TAMs 对代谢免疫逃避的潜在贡献。
在 BrM ([图 7]。
我们使用加权基因相关网络分析 (WGCNA) 并将得到的表达模式与 CD4 +和 CD8 +细胞的配对 FCM 丰度以疾病和细胞类型特异性的方式相关联。我们确定了 15 个独特的共表达模块，显示其特征基因（即模块表达数据的第一个 PC）与任何提供的样本特征显着相关（p < 0.05）（图 S7 B）。其中，“棕色”WGCNA 模块与特定的 BrM-MDM 注释和 CD4 + T 细胞丰度相关。该模块的 ORA 揭示了影响 TME 内生长因子和细胞因子的可用性和活性的途径的信号，例如凝血和 ECM 调节（图 S7 C）。。我们根据模块成员强度和与 CD4 + T 细胞丰度的相关性对基因进行排序，这确定了几个具有相反免疫调节功能的因素（图 7 F）。虽然受体CD300E和BST1促进单核细胞运动和存活，我们还检测到了免疫抑制的效应物，例如肌动蛋白相关的调节蛋白CNN2，它负向调节巨噬细胞的运动和吞噬活性。白细胞免疫球蛋白样受体 B 亚家族成员 LILRB2 和 LILRB3，它们减弱了骨髓细胞的活化，也是该模块中排名靠前的基因。有趣的是，LILRB2已被确定为一种限制抗肿瘤免疫的新型髓系免疫检查点。我们还发现了对 T 细胞影响的证据；CD52以其可溶形式抑制 T 细胞功能，属于 BrM-MDM 模块基因之一。BrM-MDMs 经历与原发性颅外肿瘤不同的疾病特异性改变的观点得到了这些基因上调的支持（图 7 G），我们分析了一组外部 BrM 样本与其匹配的原发性肿瘤组织相比（图 7G）。
discusssion
包括胶质母细胞瘤和 BrM 在内的脑肿瘤对癌症患者来说是一些最差的预后，其存活率通常在几个月内就可以测量出来。鉴于目前这些患者缺乏有效的治疗选择以及迄今为止评估的各种免疫疗法的适度效果，确定未来临床评估的新靶点至关重要。一种潜在的丰富治疗靶点来源是 TME。然而，尽管 TME 现在被广泛接受为癌症进展和治疗反应的重要调节因子，但我们对脑 TME 的了解仅限于单个脑肿瘤类型或细胞区室，缺乏全面和综合的分析。
在这项研究中，我们利用一组多样化的分析来深入探究原发性和转移性脑癌的免疫情况。通过整合多参数 FCM 分析、RNA-seq 数据、TME 细胞培养分析、蛋白质阵列和空间组织表征，我们发现了对IDH mut 和 WT 神经胶质瘤患者样本中最丰富的免疫细胞群的组成和转录组的重要见解和源自不同颅外原发性肿瘤的 BrM。
通过探索广泛的免疫领域，我们发现了神经胶质瘤和 BrM 之间的几个显着差异，当直接并排比较时。在脑肿瘤中，TAM 由组织驻留的 MG 和募集的 MDM 组成，我们发现IDH mut 和IDH WT 神经胶质瘤之间 MG 与 MDM 的比例发生了显着变化。此外，神经胶质瘤含有丰富的 TAM，而 T 细胞则少得多，尤其是在IDH mut 肿瘤中。这证实了胶质瘤是免疫冷肿瘤的概念。尽管在神经胶质瘤小鼠模型和颅内植入脑外源性肿瘤后观察到骨髓中的 T 细胞隔离，我们的临床 BrM 样本显示淋巴细胞和中性粒细胞明显积聚。这表明在大脑内出现的肿瘤确实形成了与从颅外部位转移的癌症不同的 TME。此外，在探索源自不同原发性肿瘤的 BrM 时，还存在其他差异。例如，在黑色素瘤 BrM 样本中，CD4 +和 CD8 +的组合丰度T 细胞代表主要的免疫区室，而乳房 BrM 样本显示出最高的中性粒细胞浸润。TME 领域的这些关键差异仅在直接并列不同的脑部恶性肿瘤时才明显，反映了免疫疗法的功效，这些免疫疗法在黑色素瘤患者中显示出对控制 BrM 的有希望的功效，但迄今为止在治疗排除 T 细胞的胶质母细胞瘤方面效果非常有限。
我们还发现了跨不同脑肿瘤的 TAM 的复杂多方面表型，这些表型超出了它们的数量丰度。T-MG 和 T-MDM 显示出不同的转录组学特征和共同的表达特征，这些特征还受到潜在疾病类型（IDH mut 与IDH WT 胶质瘤与 BrMs）的影响。源自IDH WT 神经胶质瘤的 T-MDM 特征，由巨噬细胞激活标志物、趋化因子受体和细胞因子组成，被证明也是IDH患者存活率的预测因子神经胶质瘤。此外，对 T-MDM 的分析表明，尽管这些募集的细胞具有处理和呈递抗原的潜力，并且可以位于 BrM 中 T 细胞的近端，但这种潜力显然没有在大脑 TME 中得到充分利用。本研究中使用的不同实验测定组的正交分析揭示了对免疫抑制潜在机制的更多见解。这些包括我们的发现，即不同的 TAM 群体产生促炎分子、骨髓细胞活化的负调节因子、与 IPRES、IDO1 和 IDO2 免疫检查点抑制剂相关的因子，以及可能共同帮助塑造免疫抑制生态位的特定 ECM 成分和蛋白酶。因此，改变 TAM 多方面表型的治疗策略，而不是简单地消耗所有这些具有潜在相反功能的细胞，应该更有效。
除了 TAM，评估中性粒细胞的作用也很重要，特别是在 BrM 中，我们发现它们非常丰富，因为它们可以作为有效的免疫抑制细胞，正如对其他器官的研究表明的那样。鉴于本研究揭示的脑癌高度复杂和多方面的免疫情况，很明显，TME 靶向药物的合理组合对于避免出现适应性耐药至关重要，并结合临床前研究来帮助确定最佳。总而言之，这一丰富的资源可供研究界进一步研究，以便我们能够共同发现新的治疗策略，释放 TME 中不同细胞对抗不同脑部恶性肿瘤的潜力。
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