参考链接：https://www.jianshu.com/p/6b7a442d293f
中文使用手册：http://cncbi.github.io/Samtools-Manual-CN/

技巧一、使用samtools view筛选具有特殊flag/质量值/scaffold的比对结果组成bam文件（一定要注意使用view的筛选功能！！）

sam中的flag的详细解释：https://www.cnblogs.com/xudongliang/p/5437850.html

1 ： 代表这个序列采用的是PE双端测序

2： 代表这个序列和参考序列完全匹配，没有插入缺失

4： 代表这个序列没有mapping到参考序列上

8： 代表这个序列的另一端序列没有比对到参考序列上，比如这条序列是R1,它对应的R2端序列没有比对到参考序列上

16：代表这个序列比对到参考序列的负链上

32 ：代表这个序列对应的另一端序列比对到参考序列的负链上

64 ： 代表这个序列是R1端序列， read1;

128 : 代表这个序列是R2端序列，read2；

256： 代表这个序列不是主要的比对，一条序列可能比对到参考序列的多个位置，只有一个是首要的比对位置，其他都是次要的

512： 代表这个序列在QC时失败了，被过滤不掉了（# 这个标签不常用）

1024: 代表这个序列是PCR重复序列（#这个标签不常用）

2048: 代表这个序列是补充的比对（#这个标签具体什么意思，没搞清楚，但是不常用）

比如我们可以通过samtools view中的-f参数，找到flag值包括2的比对结果

samtools view -f 2 -q 30  test.bam chr2:1-74455083 
如果有未知含义的flag，可以通过samtools flags查询
samtools flags 49
# 0x31    49      PAIRED,REVERSE,MREVERSE

比对在二号染色体上、flag包括2且质量值大于30的比对

技巧二、使用samtools faidx构建不同染色体的fasta

首先一定要先对fasta文件构建index

samtools faidx test.fasta

使用samtools faidx

samtools faidx chr1 test.fasta>chr1.fasta
或者提取指定未知
samtools faidx chr1:1-1000000 test.fasta>test.sub.fasta

技巧三、使用samtools depth 统计bam文件每个位置的测序深度

samtools depth test.bam
samtools depth -r chr1 test.bam #统计一号染色体上的比对的各位点覆盖深度
-r <chr:from-to>    region
# 后面跟染色体号（region）
-a  output all positions (including zero depth)
# 输入所有位置的序列，包括测序深度为0的
-q <int>    base quality threshold [0]
# 碱基质量阈值
-Q <int>    mapping quality threshold [0]
# 比对的质量阈值

一个大小为2G左右的bam文件（提前sort+index）统计所用时间为
real    7m54.912s
user    4m52.029s
sys     0m26.610s

image.png

技巧四、使用samtools flagstat统计bam的比对相关信息

samtools flagstat -@ 10 test.bam
结果：
500 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
0 + 0 secondary
0 + 0 supplementary
0 + 0 duplicates
498 + 0 mapped (99.60% : N/A)
500 + 0 paired in sequencing
250 + 0 read1
250 + 0 read2
494 + 0 properly paired (98.80% : N/A)
498 + 0 with itself and mate mapped
0 + 0 singletons (0.00% : N/A)
4 + 0 with mate mapped to a different chr
4 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)

技巧五、质量值为30、测序深度大于10的一号染色体上的比对信息

samtools view -q 30 -@ 10  test.bam chr1  |samtools index|samtools depth -r chr1 |awk '$3>10{print $0}' ->q30depth10chr1.depth

image.png