Review：3.肿瘤突变负荷（TMB）

今天和大家分享的是2018年12月发表在Translational lung cancer research（IF:4.806）杂志上关于研究肿瘤突变负荷方法的一篇综述。

Methods of measurement for tumor mutational burden in tumor tissue

肿瘤组织中肿瘤突变负荷的衡量方法

文章背景

如今以免疫检查点抑制剂为基础的免疫疗法已成为治疗不同类型晚期癌症的一种创新疗法。然而，免疫检查点抑制剂并不是对所有患者和肿瘤类型都有效的。同时，考虑到免疫治疗的成本和毒性，识别生物标志物来区分哪些患者可能对免疫治疗有反应变得十分必要。最近，研究发现肿瘤突变负荷(TMB)即肿瘤基因组每个编码区域的非同义突变的总数与免疫检查点抑制剂治疗预后有关。最初，TMB是通过全外显子测序来确定的，但由于这种方法成本高、时间长，目前又探索有针对性的panel测序来测定TMB。在不久的将来，TMB评估可能会在免疫肿瘤学中发挥重要作用。因此小编今天为大家介绍一篇以非小细胞肺癌为例讲解确定TMB的方法，及可能对其测量产生影响因素的文章。

全外显子组测序(WES)识别TMB

首先介绍的是基于全外显子组测序识别TMB。最初，研究使用肿瘤组织全外显子测序及匹配NGS技术的非肿瘤组织来衡量TMB。WES能够为多数导致肿瘤进展的突变提供一个清晰的图谱，是全基因组测序(WGS)经济有效的替代方案。然而，由于需要对肿瘤样本和匹配的正常样本进行测序，以识别肿瘤特异性改变增加了检测的成本。同时，NGS检测体细胞变异的能力主要取决于肿瘤内的变异频率及测序深度。此外，由于非肿瘤细胞的污染、肿瘤异质性和非整倍性等复杂因素的存在，想要在纯度较低或异质性较高的样品中保持较高的敏感性，可能需要进行更深层次的测序。

接下来介绍WES分析TMB的应用，TCGA等研究就是使用WES来测量不同癌症的TMB，这些研究发现TMB在多个癌症类型中广泛分布。在某些儿童癌症中，TMB非常低，而在一些广泛接触致癌物如肺癌相关的癌症中，存在多个突变，其中TMB的变化在非小细胞肺癌中尤为广泛。非小细胞肺癌吸烟患者中每Mb体细胞突变的中位数高于从不吸烟者。2015年，Rizvi等人发现，在抗pd -1治疗的晚期NSCLC患者中高TMB与临床疗效密切相关[1]。综上所述，可以发现高TMB与免疫治疗的临床疗效显著相关，但WES的成本高，并且需要大量的分析和数据处理，因此用它评估TMB是有困难的。

基因靶向测序识别TMB

传统上TMB是由WES评估的，但WES应用到临床试验有以下难点：1.检测必须在常规样本上进行，有时DNA的数量是有限的。2.检测结果必须在足够的时间内送达。3.检测结果必须准确，便于临床决策。4.这项测试必须是负担得起的。在这些意义上，对WES数据进行的初步计算研究发现基因panels测序来衡量TMB是更可取的，因为它的测序成本更低，对DNA输入要求也比较低和同时也具有更短的周转时间(TAT)。此外，与WES相比，基因panels可以更深层次的测序，并且可提高突变检测灵敏度。

在基于基因panels测序来衡量TMB的应用中，Chalmers等人发现这两种方法计算的TMBs高度相关[2]。也有研究发现两种方法之间存在良好的相关性，证实了基因panels作为衡量肿瘤突变负荷的准确性。最近，一些商业化的基因panels也被发布，不同的商业公司建议结合TMB评估和基因组分析，使用介于315~600基因之间的panels进行靶向治疗。然而，对于这些可用的panels，不仅需要进行分析，还需要进行临床验证，如果没有经过临床验证，则应该谨慎地看待这些方法获得的结果。此外，分子检测平台在靶向基因的组成方面也有很大差异。因此，跨平台的TMB测量方法的协调和阈值的定义是在临床中实施个性化医疗的一个重要步骤，所以接下来文章分析了影响TMB计算的因素。

肿瘤细胞含量和测序覆盖

第一个影响TMB计算的因素是肿瘤细胞含量和测序覆盖。与WES相比，有针对性的panels可以进行更深层次的测序。这意味着即使当样本肿瘤细胞含量较低(<10%)，当测序深度(覆盖范围)增加(500 - 1000×)时，使用这些靶向平台也能获得更高的敏感性。例如，Rizvi等人研究发现，使用 panel时，所有肿瘤样本的平均测序覆盖率为744，而使用WES时，肿瘤序列的平均覆盖率为232[3]。这可能意味着，通过使用基因panel，可以从肿瘤细胞含量较低的样本中获得关于TMB的数据，并且可以检测到较低频率的变异。然而，这种通过增加测序覆盖率而获得的更高敏感性的临床影响还没有被深入研究。

Preanalytic 因素

人为因素也是一个影响TMB计算的因素，例如，研究时将组织固定在甲醛中能保存组织和细胞形态，然而，甲醛会引发各种交联，这是一个众所周知的测序噪声来源。样本中最常见的改变是DNA片段化、胞嘧啶碱基变性和脱氨。胞嘧啶脱氨是造成NGS噪声的主要原因。这些人为因素的存在会使NGS结果的分析复杂化，特别是在分析低频突变时，这个问题对临床实验室来说极具挑战性，这也是影响TMB计算的一个重要因素。

基因靶向 panel的大小和包含的基因

基因靶向 panel的大小和包含的基因同样影响TMB的评估，当前已经有了不同范围的panel来确定TMB。在这些研究中使用最广泛包括MSK-IMPACT，其最新版本包含468个基因，而Foundation Medicine包含315个基因。最近还开发了另外两个商业化的panels，Oncomine包含409个基因，TruSight包含170个基因。对这些panels的分析结果表明，随着panels的减小，与TMB估计相关的不确定性迅速增大。此外，当靶向panels的大小小于1 Mb时，方差系数迅速增大。在这些panels选择的基因中，只有50%左右的MSK-IMPACT平台中包含的基因也出现在了foundation - one中。不同基因的研究对TMB计算的影响尚未得到分析。

生物信息学pipeline

生物信息学pipeline也会影响TMB的计算，因为其中一些研究考虑了所有的体细胞变化，包括非同义突变和拷贝数变化，而一些研究只考虑了序列突变。例如，Qiu等人比较了多个商业来源的WES数据和突变[4]。研究发现不同供应商报告的突变数量之间存在很大差异，这强调了标准化的必要性。在生物信息学的pipeline中，突变率的估计受到比对参考基因组的比对器的影响，更重要的是，受到鉴别单核苷酸变异的变异调用者或参数的影响。考虑到这些影响，制订相应标准是有必要的。

Cut-offs

对于所有的肿瘤类型，Cut-offs不一定是一致的，为了将TMB生物标记的应用转化为临床实践，应该准确地建立每个肿瘤类型的Cut-offs。研究发现晚期NSCLC患者中，大于或等于10个突变/Mb的肿瘤突变负荷被认为是联合免疫治疗的最佳获益Cut-offs，其PFS较化疗更长。但总的来说，建立高TMB肿瘤的最佳Cut-offs方法尚未确定。如今有三种类型的TMB，一种明显高(>10突变/Mb)，一种明显低(<5)，最后一种尚未确定，因此需要更多的研究来评估免疫检查点抑制剂的应答。

结论

通过这篇文章我们可以了解，TMB的评估在免疫肿瘤学中发挥重要作用[5]。然而，在常规应用中仍然具有挑战性。样本量和DNA量、不同的检测平台、不同的生物信息学pipeline、Cut-offs定义和成本是限制TMB评估的重要因素。为了保证TMB测定方法的可靠性、重复性和临床实用性，TMB测定方法需要进行规范。

参考文献

1. Rizvi NA, Hellmann MD, Snyder A, et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 2015;348:124-8.

2. Chalmers ZR, Connelly CF, Fabrizio D, et al. Analysis of 100,000 human cancer genomes reveals the landscape of tumor mutational burden. Genome Med 2017;9:34.

3. Rizvi H, Sanchez-Vega F, La K, et al. Molecular determinants of response to anti-programmed cell death (PD)-1 and anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) blockade in patients with non-small-cell lung cancer profiled with targeted next-generation sequencing. J Clin Oncol 2018;36:633-41.

4. Qiu P, Pang L, Arreaza G, et al. Data interoperability of whole exome sequencing (WES) based mutational burden estimates from different laboratories. Int J Mol Sci 2016;17.

5. Steuer CE, Ramalingam SS. Tumor mutation burden: leading immunotherapy to the era of precision medicine? J Clin Oncol 2018;36:631-2.