Biomamba荐语

这是一篇优秀的粉丝来稿，详略得当地为我们展示了主题为"单细胞测序揭示鼻咽癌微环境的基质动力学和肿瘤特异性特征"的内容，并且前来投稿时甚至排好了版面，点一个大大的赞！该文又是一篇2021发表在Nature Communication》上的文章，我个人其实对NC的文章比较偏爱，该杂志无论是写作、图片的风格都值得学习(况且一般都附带一大堆的supplement来丰富内容)。

doi:
10.1038/s41467-021-21795-z

链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-21795-z

Abstract

鼻咽癌(NPC)的肿瘤微环境(TME)中存在着一个异质性的、动态的基质群体。对这种肿瘤特异性生态系统的全面了解对提高癌症诊断、治疗和预后是必要的。为了构建完整的鼻炎基质细胞浸润的深入图谱，作者对来自14例患者进行了单细胞RNA测序，并结合了T和B细胞的克隆型鉴定。确定并描述了5个主要的基质集群和36个不同的亚种群基于遗传图谱。通过与非恶性微环境中的浸润细胞进行比较，得到了TME中具有高度代表性的特征，包括表型丰度、遗传变异、免疫动力学、克隆扩增、发育轨迹和分子相互作用，这些特征深刻影响患者的预后和治疗结果。这些关键发现在两个单细胞RNA测序队列和两个批量RNA测序队列中得到了进一步独立验证。

Background

● 1 鼻咽癌相对于其他肿瘤具有强烈的免疫浸润，并且分化程度较低；

● 2 eb病毒(EBV)感染（为什么提这个？）可以通过慢性免疫激活改变鼻咽癌微环境影响肿瘤的进展和治疗结果。

● 3 放化疗仍然是治疗鼻咽癌的一线选择，但对于晚期或转移性肿瘤患者，它往往不能达到最佳效果，免疫疗法已成为治疗许多癌症的一种很有前途的策略。

免疫治疗鼻咽癌的核心问题

缺乏对鼻咽癌微环境的全面认识，不断阻碍着治疗干预的优化。

解决核心问题前需要做的事情

● ① 阐明鼻咽癌患者和非恶性患者肿瘤浸润间质细胞的形态、动态和功能特征。
● ②充分识别和鉴别鼻咽癌微环境中，其他驻留tme的淋巴细胞、髓系细胞和成纤维细胞。

Results

● 1 单细胞RNA测序鉴定鼻咽癌微环境中的基质细胞

● 本研究共纳入14例患者，其中11例诊断为鼻咽癌，其余诊断为NLH（鼻咽淋巴增生）。单细胞测序获得66627个细胞，其中50169个细胞(75%)来自NPC微环境，16458个细胞(25%)来自非恶性微环境，平均每个细胞检测到1215个中位基因和99739个中位reads，使用Seurat R包(3.0版本)来执行下游分析，通过marker 基因将所有细胞划分为6个主要的细胞群（T细胞、B细胞、NK细胞、髓原淋巴细胞、成纤维细胞（肿瘤微环境中的基质细胞）以及肿瘤细胞）。患者间分析显示，T细胞和B细胞是鼻咽癌微环境中最主要的细胞类型，而患者6是一种非常罕见的分化型鼻咽癌，其骨髓和B细胞浸润异常，提示鼻咽癌分化程度可能影响TME间质浸润。

● 结果图中的逻辑关系

● A为单细胞测序的流程图，并且根据marker将肿瘤微环境中的细胞分为了6组，接着通过TCR和BCR的识别，看T细胞和B细胞的扩增，这是本文的一个核心的流程图；B图从左往右分别是主要细胞谱系(左)、样本类型(中)和相应的患者(右)进行颜色编码，来做初步的可视化，样本的主要组分相差不大。彼此之间可以做进一步的比较。C图是在a中定义的主要谱系的标记基因表达情况，进一步确定B中聚类的结果与分成的6个细胞组分是对应的，MS4A1是B细胞特异表达的，JCHAIN是树突状细胞的分子marker。D图使用柱状图量化了不同的微环境中主要细胞的相对丰度，发现T细胞和B细胞是最主要的细胞类型。E图对每一个样本中微环境中的主要细胞占比进行量化，并且通过F图HE染色发现鼻咽癌微环境基质浸润程度很高。

● 2 鼻咽癌和非恶性微环境中T细胞多样性的鉴定和表征

● 从32,656个T细胞中提取了14个亚群，这些细胞群代表鼻咽微环境中最常见和最多样化的细胞类型，这些亚群中鉴别出三个不同的耗竭T细胞亚群他们的标记分子分别是LAG3, HAVCR2和TOX，这些T细胞的亚群在患者之间的异质性并不强，并且在恶性以及非恶性肿瘤微环境中也相对统一，但相对丰度和激活/抑制特征存在显著差异。

● 在鼻咽癌微环境中高度富集了两个耗竭的T细胞亚群，特征是高表达免疫检查点HAVCR2和耗竭相关转录因子TOX，与HAVCR2耗竭T细胞持续分布于所有鼻咽癌患者不同的是，在9号患者中发现了广泛浸润的TOX耗竭T细胞，这表明它们是一个高度的患者特异性亚型，其他类型的T细胞，包括调节性T细胞和激活T细胞，也优先浸润在TME中，而naïve T细胞和中央记忆T细胞更可能驻留在非恶性微环境中，耗竭性和抑制性T细胞亚型在鼻咽癌患者中高度富集。作者进一步通过CD3、CD8、FOXP3和PD-1的多色免疫荧光验证了耗竭T细胞和Treg细胞在NPC肿瘤微环境有富集的情况，并且得到的结果与单细胞测序一致。这些实验结果提示功能障碍和免疫抑制T细胞向肿瘤微环境的浸润在很大程度上影响了T细胞对鼻咽癌的免疫。

● 随后作者比较了鼻咽癌和非恶性微环境来源的T细胞中的标志通路，来寻找鼻咽癌和非恶性肿瘤微环境中T细胞中的相关信号通路的差异。途径分析显示，干扰素-γ (IFN-γ)反应和干扰素-α (IFN-α)反应在npc来源的T细胞中上调，提示由于慢性激活导致的1型和2型干扰素(IFNs)的过量产生可能显著影响浸润T细胞的组成和功能状态，来源于非恶性微环境的T细胞主要受核因子κ -轻链活化B细胞(NF-κB)通路的影响，其他途径，如糖酵解、同种异体排斥反应和氧化磷酸化在TME驻留的T细胞中表现出较高的偏好。

● 进一步证实鼻咽癌浸润与非恶性微环境中T细胞的分子差异。作者通过MAST分析来识别T细胞中的差异表达基因(DEGs)，在所有的DEGs中，通过RegNetwork预测了前30个上调基因的上游转录因子，并通过Cytoscape构建了基因调控网络，发现CXCL13和LGALS1在NPC来源的 T细胞中显著上调。CXCL13是卵泡T辅助细胞的基因标志之一，但也发现它在耗尽的T细胞，特别是PD-1+ T细胞上高度表达，作者根据基因表达的中位数将鼻咽癌患者分为cxcl13 -高和cxcl13 -低两组，观察到cxcr13 -高的患者CXCR5+ B细胞的比例明显更高，此外，CXCL13的高表达与鼻咽癌患者更好的无进展生存相关，这表明CXCL13高耗尽的T细胞可能仍然有利于免疫调节。LGALS1在npc相关的treg中高表达，在lgals1高的患者中，免疫抑制的Treg的比例明显高于静止的Treg，这表明它可能在Treg激活中发挥重要作用。此外，基于基因调控网络，发现S100A11和S100A4在LGALS1+ Treg中表达上调，并预测其与LGALS1相互作用，表明其调控作用可能通过钙通道依赖过程发挥作用（可能的机制提出，背景知识是：CXCL13与CCR5之间的关系是什么？为什么去检查CCR5的含量？）。

● 3 功能模块、克隆分析和发育轨迹揭示了耗竭T细胞和Treg在鼻咽癌微环境中的动态变化

●作者构建了包含与代表性基因相关度最高的10个基因的基因图谱。基于这些基因图谱，利用glm函数在naïve T细胞、细胞毒性T细胞、耗尽T细胞和treg中建立了广义线性模型。广义线性模型根据基因图谱中的每个基因的表达权重分配一个不同的参数。随后，根据模型估计的参数计算功能评分，这些参数代表某些细胞类型的相对丰度。

● ① 功能模块：首先对CD8+ T细胞簇内的细胞毒性程序进行了定量比较。结果表明，耗竭的T细胞簇(C5、C6和C7)维持着中到高的细胞毒性活性，而不是终末期功能失调，这表明可能存在一个过渡过程，在TME中，效应T细胞由于慢性激活和肿瘤依赖机制而逐渐失去细胞毒性，说明从激活到耗竭的转变确实是一个动态过程，T细胞可以处于前期耗竭、中期耗竭或晚期耗竭状态；naïve程序对所有T细胞的定量分析显示，CD4+和CD8+ naïve T细胞的naïve评分较高。对Treg程序的分析表明，抑制Treg比休眠Treg具有更强的免疫调节能力（如何得到这一结论的？）。同时作者还使用了数据库中的数据验证了线性模型的可靠性。

● ② 克隆分析：为了描述浸润T细胞在鼻咽癌和非恶性微环境中的克隆多样性，作者系统地分析了通过耦合V(D)J谱分析获得的单个T细胞上的TCRs的身份。总的来说，平均每个病人身上检测到2071个独特的克隆型。正如预期的那样，克隆型在不同的患者中高度可变，但克隆大小的组成在鼻咽癌和NLH患者中保持相对一致。因此，根据每个克隆分配的细胞数将克隆型分为三类(参考克隆大小≥3，=2，=1)，在鼻咽癌患者中发现较大克隆大小(克隆大小≥3和=2)的比例显著富集，表明在TME中T细胞克隆扩增强烈，相比之下，T细胞在非恶性微环境中的扩张相对静态，因为其主要以克隆性小的T细胞为主(克隆大小= 1)，随后计算了4-13例患者的衰竭和Treg评分，发现这两个评分都与大克隆性呈正相关。这一结果表明，耗尽的T细胞和treg在TME中进行了快速的克隆扩增，最终导致这些T细胞亚型在鼻咽癌患者中更高的丰度。

● 为了进一步了解克隆扩增及其对T细胞动力学的影响，作者将每个患者中最大的前三个克隆及其对应的克隆型投影到UMAP上。在大多数鼻咽癌患者中，激活的(C2和C3) T细胞和耗竭的(C5、C6和C7) T细胞具有相同的克隆型，验证了激活-耗尽过渡的存在。同时作者还发现大量的tox2耗竭T细胞与havcr2耗竭T细胞具有相同的克隆型。由此，不同簇中耗竭T细胞并不是完全独立的，从一个耗竭的亚型到另一个耗竭的亚型可能发生状态转换，即从havcr2耗竭到tox耗竭，或从havcr2耗竭到tox耗竭。同时实验中还发现，大量增殖的T细胞也与耗竭的T细胞共享相同的克隆型，这表明耗竭的程序经常伴随着增殖的升高。随后，作者进行了TCR基序分析，发现尽管大多数基序在来自NPC或NLH微环境的T细胞中是一致的，但仍有一小部分TCR模式是NPC特异性的。C5-LAG3、C6-HAVCR2和C7TOX不同转录状态的耗竭T细胞表现出不同的细胞毒性和耗竭活性，这表明耗竭T细胞的异质性可能是由于从激活到耗竭的过渡和扩增克隆引起的。

● ③ 发育轨迹：通过Monocle v2对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行独立的伪时间发育轨迹，这一发育轨迹提供了一种独特的可视化方法来推断鼻咽癌和非恶性微环境中T细胞的谱系结构。CD8+ T细胞轨迹显示，HAVCR2耗竭、Tox3耗竭、LAG3耗竭的T细胞和TRM？分别位于不同分支的末端，表明了它们不同的发育过程，效应T细胞和记忆效应T细胞位于两者之间，表明它们处于中间发育状态。进一步证明耗竭是CD8+ T细胞发育的终末阶段。CD4+ T细胞也表现出从naïve T细胞到Treg细胞、中央记忆T细胞和T滤泡辅助细胞的过渡过程。静息态Tregs被认为较早发展的亚型，抑制态Tregs作为一种更成熟的形式，具有更强的免疫调节能力，并具有更强的克隆扩增能力。

● 4 B细胞特异性特征和B细胞亚型的NPC相关功能的预后价值

● ① NPC中B细胞特异性特征

●以前认为肿瘤微环境中B细胞是相对同质的细胞群体，作者在11种不同的亚型中检测到了27,506个B细胞，这是TME中第二大和第二主要的基质细胞类型，在鼻咽癌组织中有独特的先天性B细胞簇和生发中心B细胞簇。患者2、患者6和患者7的血浆B细胞特异性富集，主要参与了细胞间的相互作用B细胞在鼻咽癌微环境中的异质性。血浆B细胞和切换记忆B细胞数量在TME中明显增加，但由于患者间差异较大，未达到统计学意义。在非恶性微环境中，共发现naïve B细胞和固有样B细胞富集，而在NPC中， ifn诱导的B细胞(包括naïve形式)和双阴性B细胞富集，从批量RNA测序数据中，反褶积分析证实血浆B细胞和双阴性B细胞更容易渗透到鼻咽癌微环境中，而泛B细胞，包括naïve B细胞、未活化B细胞和固有样B细胞，在非恶性微环境中优先富集。

●此外，NPC来源的B细胞和NLH来源的B细胞之间的遗传差异很少，说明B细胞的肿瘤相关功能可能在很大程度上取决于其丰度，而不是遗传调控或细胞因子分泌的差异。NPC来源的B细胞中差异表达基因主要为干扰素诱导和免疫球蛋白编码基因，包括IFITM1、IFI44L、IGHA1、IGKC和IGHG3，与T细胞亚群的结果一致。B细胞通路分析显示，NPC来源的B细胞也很大程度上受IFN-γ和IFN-α过量释放的影响，而NLH来源的B细胞则因炎症紊乱而改变。（2）B细胞亚型的NPC相关功能的预后价值

●肿瘤浸润B细胞的存在通常与更好的总体生存和治疗结果相关，我们选择了几种具有代表性的B细胞标记(CD79A, MS4A1, IGHD, nd FCRL4)，并检查它们在鼻咽癌患者中的预后价值。生存分析显示，特征基因与鼻咽癌患者较好的无进展生存显著相关，提示B细胞在抗鼻咽癌免疫中发挥积极作用。

●为了进一步了解浸润B细胞的功能，作者进行了克隆分析，以量化每个患者克隆型的分布和多样性，作者平均在每个患者检测到2419个独特的克隆型，结果发现，较大的B细胞克隆在鼻咽癌患者中显著富集，而较小的B细胞克隆在NLH患者中富集。随后，作者对B细胞的发育轨迹进行了研究，揭示了从naïve B细胞到不同类型成熟B细胞的发育谱系，包括血浆B细胞、切换记忆B细胞和ifn诱导的B细胞。同时还发现许多B细胞亚型处于中间发育状态，如未激活B细胞、生发中心B细胞和双阴性B细胞。

● 5 鼻咽癌微环境中髓系亚群的异质性和动态

●3671个骨髓细胞聚集在11个亚群中，作者发现95%的细胞来自鼻咽癌患者，这表明骨髓积累是一个依赖于鼻咽癌的过程，单细胞数据显示，存在三种主要的髓系成分，包括骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)。与T细胞和B细胞亚群相比，髓系细胞，尤其是TAMs，在患者间变异和组织特异性的驱动下表现出广泛的异质性。NPC源性髓系细胞和NLH源性髓系细胞通路的富集证实了IFNs的存在也严重地改变了鼻咽癌患者的髓系结构，MAST分析和基因调控网络显示M2和M1极化相关基因在TAM中共表达，包括FCGR3A、FCGR2A、TREM2和APOC1，提示TAM亚群可能比传统的M1/M2分类更为复杂，其发育轨迹验证了髓系细胞的动力学。

●反褶积分析显示MDSC在鼻咽癌患者中高度富集，dc不仅存在于TME中，而且在非恶性微环境中也经常浸润，没有统计学意义。巨噬细胞主要为肝细胞、肝细胞、肝细胞、肝细胞和肝细胞。c1 -FOLR2和C2CCL20 TAMs发育程序不同，C3-FCGR2B TAMs主要位于中间，表明其发育处于中间状态。包括C10-S100A9和C11-NFKB1在内的MDSCs主要位于第4支末端，这表明它们是发育相似但转录不同的亚型。

● 6 成纤维细胞和NK细胞作为鼻咽癌治疗的微环境靶点

●在鼻咽癌微环境中，成纤维细胞和NK细胞代表两种小亚群，MAST分析揭示了成纤维细胞和NK细胞中不同的基因表达谱(补充图S7e)。编码细胞外基质(ECM)成分的基因如COL1A1、COL1A2、LUM和FN1在成纤维细胞中特异表达，这表明在鼻鼻癌微环境中的ECM是高度复杂的，可能通过整合素信号与周围的肿瘤和基质细胞相互作用。因此，抑制肿瘤和免疫细胞上特定的整合素受体可能是一个潜在的治疗靶点，以破坏ecm依赖的肿瘤进展和抑制免疫调节。与效应T细胞类似，NK细胞通常表达高水平的细胞毒性基因，包括NKG7、GZMA、GZMB和GZMH。而GNLY和KLRD1在NK细胞中优先表达。研究进展表明，NK细胞在慢性激活后也可以表现为KIR、NKG2A、LAG3和HAVCR243、44的上调，但我们没有观察到这些衰竭标志物在NK细胞中上调。此外，NK细胞差异表达趋化因子编码基因XCL1和XCL2，这是先前报道的招募CCR5+ DCs。由此可见，NK细胞在鼻咽癌微环境中仍然保持免疫激活状态，可能在鼻咽癌免疫应答中发挥正向调节作用。

● 7 免疫动力学与患者生存的相关性，以及浸润免疫细胞中的细胞-细胞通讯

●通过CIBERSORTx对88例鼻咽癌患者的rnas测序数据进行反卷积，估计免疫丰度，根据免疫丰度将患者进一步分为三组，分别为激活的肿瘤免疫微环境(TIME，聚类1和2)或灭活的肿瘤免疫微环境(聚类3)。计算每个患者的功能评分并归一化，用于表征T细胞的动态状态。

●随后，我们评估了每个免疫亚型和患者群体的风险比。结果显示耗竭的T细胞与更好的无进展生存相关，而其他T细胞亚型与生存没有显著相关性。此外，血浆B细胞、dc和巨噬细胞丰度较高也与预后较好有关。与之前的研究一致，鼻咽癌患者中双阴性B细胞和MDSCs比例较高预示无进展生存较差。因此，靶向双阴性B细胞和MDSCs可能是一种有前景的鼻咽癌治疗方法，但需要进一步研究以充分了解这些亚型在鼻咽癌微环境中的分子机制。此外，t免疫评分低或TIME灭活的患者预后较差。目前还缺乏鼻咽癌患者分层、生存预测和治疗评价的临床模型。结合功能模块的单细胞转移方法增强了其作为疾病分类、预测生存和治疗结果的集成和可行模型的可靠性，但仍需要在更大的临床队列中验证我们的研究结果。

●为了描述来自鼻咽癌微环境和来自NLH微环境的细胞之间的分子相互作用的差异，我们应用CellPhoneDB在38个确定的亚群中通过已知的配体受体对构建了一个细胞-细胞通信网络，作者可视化了主要T和B亚群中的细胞通信。结果表明，TME中三个耗竭的T细胞簇(HAVCR2、TOX和LAG3)优先与记忆B细胞、先天样B细胞、未激活B细胞、ifn诱导的B细胞相互作用，但与血浆B细胞、naïve B细胞和双阴性B细胞不相互作用，因为这些亚型缺乏相互作用对。此外，还发现了在T细胞和B细胞通信中不断参与的特异性配体-受体对。并且发现，与抑制型treg相比，休眠型treg与耗竭型T细胞的交互配对要少得多，这表明它们是一种不那么有活力和免疫抑制的亚型。与上述研究结果一致，在TME中，HAVCR2和TOX耗竭的T细胞与不同的B细胞亚群表现出强烈的相互作用，主要通过CXCL13-CXCR5轴。值得注意的是，与非恶性T细胞相比，来自NPC的耗竭T细胞和抑制treg细胞拥有更多的配体受体对，而休息treg细胞、双阴性B细胞和组织常驻T细胞拥有的配体受体对更少。