为全面了解基质浸润的复杂性并揭示鼻咽癌（NPC）的特征，香港大学深圳医院运用单细胞测序技术，对NPC微环境进行研究，揭示了肿瘤微环境（TME）中的分子异质性以及对肿瘤进展和治疗结果的潜在影响。相应研究结果于2021年3月发表于Nature Communications（IF：14.919）。
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单细胞测序揭示鼻咽癌微环境中的基质动力学和肿瘤特异性
Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma
发表杂志：Nature communications（IF：14.919）；
发表时间：2021年3月；
应用技术：10x Genomics单细胞免疫组库测序；
研究背景
鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽上皮的鳞状细胞癌。最近，免疫治疗已经成为治疗许多癌症的一种很有前景的策略，然而，目前尚缺乏对鼻咽癌微环境（TEM）的全面认识，一直阻碍着对干预治疗的优化。因此，进一步阐明鼻咽癌患者和非恶性肿瘤患者肿瘤浸润间质细胞的形态、动态和功能特征非常必要。
为了全面揭示基质浸润的复杂性以及NPC特异性特征，本研究对14例鼻咽癌（NPC）或鼻咽部淋巴增生（NLH）患者进行10x Genomics单细胞免疫组库测序，通过对鼻咽癌微环境基质细胞和非恶性基质细胞的深入分析，揭示了TME内部的分子异质性及其对肿瘤进展和治疗结果的潜在影响。
主要结果
1.单细胞转录组测序鉴定鼻咽癌微环境中的基质细胞
本研究共纳入14例患者，其中NPC患者11例，其他患者为NLH。单细胞转录组测序获得了66,627个细胞，其中50,169个细胞（75%）来自鼻咽癌微环境，16,458个细胞（25%）来自非恶性微环境，平均每个细胞检测到1,215个（中位数）基因，利用Marker基因将细胞分为6个主要的细胞群。不同患者间分析表明，T细胞和B细胞是鼻咽癌微环境中最主要的细胞类型，但患者6为非常罕见的分化型鼻咽癌，骨髓和B细胞浸润异常，提示鼻咽癌分化程度可能影响TME间质浸润。
单细胞分辨率下鼻咽癌和鼻咽部淋巴样增生的微环境景观
2.鼻咽癌和非恶性微环境中T细胞多样性的鉴定和特征
32,656个T细胞聚类为14个亚群，利用Marker基因表达和功能特征来鉴定和描述肿瘤浸润T细胞亚群。尽管大多数T细胞亚群在患者间具有较小的异质性，并且主要在恶性和非恶性微环境中共享，但相对丰度和激活/抑制特征有很大的差异 。其他亚型的T细胞，包括调节性T细胞和活化T细胞，也优先浸润于TME，而初始T细胞和中央记忆T细胞更可能存在非恶性微环境中。进一步生信分析也证实了该发现：效应T细胞亚型、耗竭T细胞亚型和抑制性T细胞亚型在NPC患者中高度富集。这些结果提示，严重的功能失调性和免疫抑制T细胞浸润在很大程度上影响了T细胞对NPC的免疫。功能途径分析表明，NPC来源的T细胞与NLH来源的T细胞相比，表现出明显的功能差异。
耗竭型和免疫抑制T细胞表型的富集是鼻咽癌微环境的肿瘤特异性特征
为了进一步证实鼻咽癌中T细胞浸润与非恶性微环境之间的分子差异，本研究进行了MAST分析，以确定T细胞中的差异表达基因（DEGs）。通过RegNetwork预测前30个上调基因的上游转录因子，并通过Cytoscape构建基因调控网络，发现CXCL13 和LGALS1 在NPC的T细胞中显著上调。在鼻咽癌患者中，更高的CXCL13 表达与更好的无进展生存相关，提示CXCL13 高的耗竭T细胞可能仍然有利于免疫调节，LGALS1 在多种免疫细胞中具有免疫调节功能。另外，基于基因调控网络，发现S100A11 和S100A4在LGALS1+ Treg中上调，并预测其与LGALS1互作，提示其调控作用可能通过钙通道依赖过程发挥。
3.功能模块、克隆分析和发育轨迹揭示了耗竭T细胞和Treg细胞在鼻咽癌微环境中的动态
下游分析揭示了一组丰富的功能模块，它们与T细胞亚群中的幼稚、细胞毒性、耗竭以及免疫调节程序相关。进一步基于构建的相关基因图谱，在幼稚T细胞、细胞毒性T细胞、耗竭T细胞和Tregs中建立了广义的线性模型，根据模型估计的参数计算功能评分，这些参数代表了某些细胞类型的相对丰度。
首先对CD8+ T细胞簇内的细胞毒性程序进行了定量比较。结果表明，耗竭的T细胞群（C5、C6和C7）保持了中到高的细胞毒性活性，而不是最终功能失调，表明在TME中，由于慢性激活和肿瘤依赖机制，效应T细胞逐渐丧失细胞毒性。另外，耗竭不仅在耗竭T细胞中被诱导，也在效应T细胞中被诱导，只是程度较低，说明激活到耗竭的转变是一个动态过程，T细胞可能处于原始、中间或晚期衰竭状态。与聚类一致，幼稚程序对所有T细胞的定量分析显示，CD4+ 和CD8+ 幼稚T细胞的幼稚评分较高。对Treg程序的分析表明，抑制Treg比静息Treg具有更强的免疫调节能力。这种能力的增加可以通过抑制性Tregs的高表达刺激分子编码基因的来解释。另外，本研究还进一步验证了线性模型的可靠性。
NPC特异性T细胞特征的鉴定及其与患者预后和T细胞动力学的相关性
为了描述鼻咽癌和非恶性微环境中浸润的T细胞的克隆多样性，本研究系统地分析了从偶联V（D）J分析中获得的单个T细胞上的TCR。平均检测到每个病人2,071个独特的克隆型，不同患者的克隆型变化很大，但鼻咽癌和NLH患者的克隆大小组成仍然相对一致。进一步分析结果表明，TME中耗竭T细胞和Treg细胞进行了快速克隆扩增，最终导致这些T细胞亚型在鼻咽癌患者中的丰度更高。将每个患者中最大的三个克隆及其相应的克隆型进行UMAP分析，进一步证实了激活-耗竭转换的存在。并且可推断出不同亚群中耗竭T细胞并非完全独立，状态转换可能发生在一个衰竭亚型到另一个亚型之间，或者相反。另外，衰竭的程序通常伴随着增殖的升高。
对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行拟时间发育轨迹分析。结果表明，CD8+ T细胞的衰竭是CD8+ T细胞发育的终末阶段，通过TME调节对耗竭T细胞进行重编程可能成为一种重新激活抗肿瘤免疫的可行的治疗方法。CD4+ T细胞的轨迹也表现出从幼稚 T细胞向Treg、中央记忆T细胞和T滤泡辅助细胞的过渡过程。总之，抑制型Treg作为一种更成熟的形式，具有更强的免疫调节能力，并经历了更强大的克隆扩增。
单细胞V(D)J测序揭示了耗竭型和免疫抑制型T细胞的克隆扩增和从激活到衰竭的转变
4.B细胞特异性以及B细胞亚型的NPC相关功能的预后价值
本研究鉴定到11个不同亚型的27,506个B细胞，在鼻咽癌中发现了独特的先天性和生发中心B细胞簇，患者2、患者6和患者7血浆B细胞特异性富集，促进了鼻咽癌微环境中B细胞在患者间的异质性。进一步分析证实血浆B细胞和双阴性B细胞更容易在NPC微环境中浸润。而泛B细胞，包括幼稚B细胞、未激活B细胞和先天性B细胞，在非恶性微环境中优先富集。与T细胞亚群的结果一致，B细胞的途径分析显示，NPC来源的B细胞也在很大程度上受到IFN-γ和IFN-α过度释放的影响，而NHL来源的B细胞由于炎症失调而发生改变。另外，本研究检测到每个病人平均2,419个独特的克隆型，与T细胞的结果相似，鼻咽癌患者中较大的B细胞克隆显著富集，而NLH患者中较小的B细胞克隆更丰富。
免疫激活和IFN相关B细胞的克隆扩增和富集是鼻咽癌微环境中的肿瘤特异性特征
5.NPC微环境中髓系亚群的异质性和动态
3,671骨髓细胞可分为11个亚群，95%的细胞来自NPC患者，表明骨髓细胞积累是一个NPC依赖的过程。数据显示存在三种主要的髓系谱系成分, 包括髓样抑制细胞（MDSC）、巨噬细胞和树突状细胞（DC）。与T细胞和B细胞亚种群相比，髓细胞，特别是TAM，在患者间差异和组织特异性的驱动下显示出广泛的异质性。NPC和NHL来源的髓系细胞的通路富集证实，IFN的存在也严重影响了鼻咽癌患者的髓系结构。另外，发育轨迹验证了骨髓系细胞的动力学。
NPC 微环境包含具有高患者特异性异质性的抑制性骨髓亚型
6.成纤维细胞和NK细胞在鼻咽癌治疗中作为基于微环境靶标
成纤维细胞和NK细胞代表了鼻咽癌微环境中的两种小亚群。成纤维细胞在鼻咽癌患者中大量富集。MAST分析揭示了成纤维细胞和NK细胞中不同的基因表达谱。编码细胞外基质（ECM）成分的基因被成纤维细胞特异性表达，提示NPC微环境中的ECM高度复杂，可能通过整合素信号与周围肿瘤和基质细胞相互作用。因此，抑制肿瘤和免疫细胞上的特定整合素受体可能成为一个潜在的治疗靶点，以中断依赖ECM的肿瘤进展和抑制免疫调节。
7.免疫动力学与患者生存率以及浸润的免疫细胞间通信的关系
利用单细胞测序数据生成了一个表达矩阵，包含733个具有代表性的基因，分别针对T细胞、B细胞和髓系细胞中选定的主要亚群。根据免疫丰度，将患者进一步分为三类，即激活的肿瘤免疫微环境（TIME，簇1和2）或灭活的TIME（簇3）。还计算并标准化了每个患者的功能评分，随后将其用于描述T细胞的动态（图8b）。随后，评估了每种免疫亚型和患者群的危险比。结果表明，耗竭的T细胞与更好PFS相关，而其他T细胞亚型与生存没有显着相关性（图8c）。此外，浆细胞，DC和巨噬细胞的丰度预后正相关。高表达双阴性B细胞和MDSC与预后成反比。
反褶积分析和功能模块揭示了与患者预后相关的动态免疫特征
应用CellPhoneDB软件，通过38个已确定的亚群中已知的配体受体对构建了一个细胞-细胞通信网络。由于T细胞和B细胞在微环境中高度浸润，可以观察到主要T和B亚群内的细胞通讯。结果显示，耗竭型T细胞的三个簇（HAVCR2，TOX 和LAG3）在TME中由于缺乏相互作用对，而优先与记忆B细胞，先天性B细胞，未激活的B细胞，IFN诱导的B细胞相互作用，但不与浆细胞，幼稚B细胞和双阴性B细胞相互作用。与抑制性Tregs相比，静止的Tregs与衰竭的T细胞之间的相互作用对要少得多，这表明它们是一个动态和免疫抑制性较差的亚类型。与上述发现一致，TME中的HAVCR2 和TOX 耗竭的T细胞主要通过CXCL13–CXCR5与各种B细胞亚群相互作用。值得注意的是，与非恶性对应物相比，NPC来源的耗竭T细胞和抑制性Treg具有更高数量的配体-受体对，而静止的Treg，双阴性B细胞和组织驻留T细胞较少。
单细胞参考通讯分析显示了 T 细胞和 B 细胞亚群内的肿瘤特异性配体-受体相互作用
研究结论
本篇文章分析了14位患者的104,069个细胞，并揭示了38个不同的基质种群，包括成纤维细胞，NK细胞以及T细胞，B细胞和髓样细胞的不同亚型，发现了许多NPC特异的特征与患者的生存相关，例如TME中存在从激活的T细胞到衰竭T细胞的动态过渡过程，这表明NPC患者中各种基质亚群的相对丰度和免疫激活状态直接影响了肿瘤的发展和治疗结果。该发现为使用这些标记物作为生物标志物以及早期诊断和预后的靶标提供了新的机会。
参考文献
Gong L, Kwong DL, Dai W, et al. Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma.Nat Commun. 2021; 12(1): 1540.
李超 | 文案
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