RNA-seq的老套路分析

之前在简书上看过一篇文章https://www.jianshu.com/p/1f5d13cc47f8是重复16年发表在NATURE PROTOCOLS上面的一篇处理RNA-seq数据的文章，文章名字是：Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown，主要讲了用Hisat2、StringTie、Ballgown三款软件对转录组的数据进行分析，这三款软件的分析效率比较高，今天我尝试用大家熟悉的老套路老方法分析下这组数据。
文章中的所有数据如下图，我是用win10中wsl系统进行分析的（无奈，没有服务器啊！），在这就不做质控了，直接从建立索引开始。

上图中的indexes是hisat2的索引文件，在这里我们用老套路中的bowtie重新构建索引。
我的是Ubuntu系统，安装bowtie2直接命令行

$ sudo apt install bowtie2
#bowtie2建立chrX索引
$ bowtie2-build chrX.fa chrX

构建好的索引和chrX.fa放在一起，如下图

然后用tophat2进行比对，为了节省时间，写了个脚本1.sh：

for i in {188044,188144,188145,188257,188273,188337,188383,188401,188428,188454,
204916};do tophat2 –p 4 –o ERR${i}-out /mnt/f/data/chrX_data/genome/chrX ./samples /ERR${i}_chrX_1.fastq.gz ./ samples /ERR${i}_chrX_2.fastq.gz 
done

但是在执行时却出现了报错，具体报错信息贴在下面了：

哪位大神能够给指导下，在线等·······································

只能用笨方法了，还好就只有12个样本，所以在比对结束后输出12个文件夹，如下图
而每个输出文件的内容大概有以下6个文件和一个日志文件夹，以输出的ERR188044为例：

接下来分析我们主要用到accepted_hits.bam文件，利用cuffdiff基于参考注释对这12个样本进行表达差异分析，具体代码如下：

cuffdiff -o expdiff –b ./genome/chrX.fa –L ERR188044, ERR188104, ERR188234, ERR188245, ERR188257, ERR188273, ERR188337, ERR188383, ERR188401, ERR188428,ERR188454,ERR204916 -u ./genes/chrX.gtf ./ERR188044-out/accepted_hits.bam ./ERR188104-out/accepted_hits.bam ./ERR188234-out/accepted_hits.bam ./ERR188245-out/accepted_hits.bam ./ERR188257-out/accepted_hits.bam ./ERR188273-out/accepted_hits.bam ./ERR188337-out/accepted_hits.bam ./ERR188383-out/accepted_hits.bam ./ERR188401-out/accepted_hits.bam ./ERR188428-out/accepted_hits.bam ./ERR188454-out/accepted_hits.bam ./ERR204916-out/accepted_hits.bam 

接下来就利用R语言中cummeRbund包对结果进行可视化分析了，你们自由发挥吧。
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