STAR从version2.7开始支持对scRNA-seq的定量，随着版本的升级，从一开始只支持Droplet类型到现在可以涵盖几乎所有类型。下面内容以version2.9版本为基础来讲解。
首先，定量前先要搞清楚scRNA-seq文库的类型，对应控制文库类型的参数为--soloType，目前市面上常见的几个建库方式如10x、Smart-seq，STAR都有相应的参数来匹配。
10X (Drop-seq)
标准的Drop-seq文库类型如10x，则soloType的参数设置为CB_UMI_Simple，再配合与Barcode和UMI相关的四个参数，代码示例如下：
STAR --runThreadN 10 \
--genomeDir reference_data \
--readFilesIn Read2.fastq.gz Read1.fastq.gz \
--readFilesCommand zcat \
--outFileNamePrefix sample \
--soloType CB_UMI_Simple \
--soloCBstart 1 \
--soloCBlen 16 \
--soloUMIstart 17 \
--soloUMIlen 10 \
--soloCBwhitelist whitelist \
--soloFeatures GeneFull
上面的代码适用于10x V2试剂盒，如果是10x V3试剂盒则需要修改一下UMI长度：--soloUMIlen 12。这里需要特别注意fastq的输入顺序，第一个fastq必须是真实的cDNA序列，第二个fastq是Barcode和UMI序列，如10x的read1里面为Barcode和UMI，所以此处的fastq顺序为Read2、Read1。
如果想让STAR的结果与CellRanger 3.x.x版本的结果吻合，可以在上面初始代码的基础上再追加一些代码：
--soloCBmatchWLtype 1MM_multi_Nbase_pseudocounts \
--soloUMIfiltering MultiGeneUMI_CR \
--soloUMIdedup 1MM_CR
或者，想让STAR的结果与CellRanger >= 4.0版本的结果吻合，可以在上面初始代码的基础上追加如下代码：
--clipAdapterType CellRanger4 \
--outFilterScoreMin 30 \
--soloCBmatchWLtype 1MM_multi_Nbase_pseudocounts \
--soloUMIfiltering MultiGeneUMI_CR \
--soloUMIdedup 1MM_CR
对于Drop-seq类型来说，还有一些特殊情况，如可能某一个fastq文件不仅包含Barcode和UMI序列，还有cDNA序列。这时，还需要额外一些参数来对应调整，这类情况比较少见，这里就不详细介绍了，知道STAR也可以应对即可，如果真的需要可以去查阅官方文档。
Smart-seq
Smart-seq跟普通的bulk RNA类似，每一个细胞的fastq都是独立的，所以没有Barcode和UMI，需要设置一些其他参数来适应。为了方便完成所有细胞的定量，可以事先准备一个sample sheet内容以制表符分隔，格式如下：
sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz Cell-id1
sample2_R1.fastq.gz sample2_R2.fastq.gz Cell-id2
完整的示例代码如下：
STAR --runThreadN 10 \
--genomeDir reference_data \
--readFilesCommand zcat \
--outFileNamePrefix sample \
--soloType SmartSeq \
--readFilesManifest manifest.tsv \
--soloUMIdedup Exact \
--soloStrand Unstranded \
--soloFeatures GeneFull
Smart-seq通常是非链特异性的文库，如果是链特异性的文库，可以相应地修改soloStrand参数的值为Forward或者Reverse，默认为Forward。
万能公式
为了应对更为复杂的建库方式，STAR有一个复杂模式，不仅可以应对像10x这样的Drop-seq，还能应对一些个性化的文库方案。其实，单细胞文库的复杂本质上是由于Barcode和UMI的加入。为了应对复杂的Barcode和UMI情况，可以将参数soloType的值修改为CB_UMI_Complex，这样就会启用一些配套的参数来寻找细胞对应的Barcode和UMI，由此完成定量。
其中，涉及到两个很重要的参数soloCBposition和soloUMIposition，这两个参数的值规则一致且相当灵活，参数值的形式为startAnchor_startPosition_endAnchor_endPosition，搞明白了参数值的意义，基本上就可以搞定所有Drop-seq类型文库的定量了。
如此，Barcode和UMI序列就可以用四个值来确定，分别为startAnchor、startPosition、endAnchor、endPosition。其中startAnchor和startPosition确定序列的起始位置，startPosition为相对startAnchor的位置；endAnchor和endPosition确定序列的结束位置，endPosition为相对endAnchor的位置。例如startPosition为2时，即startAnchor的后面第二位为起始点，endPosition同理。另外，Anchor的类型分为0-3四种情况，分别为0: read start; 1: read end; 2: adapter start; 3: adapter end。
所以，就可以用这四个值的组合来确定序列，需要注意的是，这些参数值都是0-based，并且Adapter可有可无，如果有且只能有一个，如果有需要使用参数soloAdapterSequence来提供。
下面用一个具体的例子来说明，如上图展示了一种复杂的文库类型，其中read包含了两个Barcode，一个Adapter，一个UMI。例如Barcode1长度为8bp，那么，如下的代码为一种可以确定其序列的方法：
--soloCBposition 0_0_0_7
0_0_0_7代表的含义就是：startAnchor和endAnchor值都为0，即分别以read的起始位置做为Barcode的起始和结束的Anchor；startPosition的值为0，也就是以startAnchor的位置为起点，也即read的起始位置；endPosition值为7，即endAnchor后面的第7位为结束。所以，也就是说Barcode1为read序列的前8个碱基。
此外，还可以应对更复杂一点的情况，比如Barcode1的长度是不确定的，此时就可以利用Adapter作为结束的Anchor来确定序列，代码示例如下：
--soloCBposition 0_0_2_-1
endAnchor值为2，即以Adapter的起点作为Barcode1的结束Anchor；endPosition值为-1，即Adapter起点的前一位为结束。所以，Barcode1序列为从read起始位置开始到Adapter起点的前一位结束。这样就实现了Barcode序列长度不确定时的提取。
同理，通过参数soloUMIposition以同样的方式来确定UMI序列。下面给出一个完整版的代码示例：
STAR --runThreadN 10 \
--genomeDir reference_data \
--readFilesIn Read1.fastq.gz Read2.fastq.gz \
--readFilesCommand zcat \
--outFileNamePrefix sample \
--soloType CB_UMI_Complex \
--soloCBposition 0_0_0_7 3_1_3_8 \
--soloUMIposition 3_9_3_14 \
--soloAdapterSequence adapter_sequence \
--soloCBwhitelist whitelist \
--soloFeatures GeneFull
soloCBposition参数可以提供多个值，与文库中Barcode的顺序保持一致。为什么说这个是万能公式？此时大家应该可以想象到，如上面的文库示意图，若没有Barcode1和Adapter的话就是普通的Drop-seq类型，与10x文库一致。注意，此时fastq的输入顺序还是与上面提到的规则一致。
其他事项
最后，补充一点，如果后续需要使用bam文件做一些其他分析，有可能会使用到一些额外的属性如CB、UB属性，最好在定量时就添加一个参数，在bam里面生成这些属性，如下所示：
--outSAMattributes CB UB
STAR做为分析转录组的知名软件，功能十分强大，这从软件惊人的参数数量上也可以体现出来。大部分参数都可以根据软件的帮助文档了解其用途，但有些参数理解起来还是有些吃力，比如单细胞定量复杂模式下的soloCBposition，对于该参数的理解得感谢办公室小伙伴的帮助。至此，用STAR就可以轻松搞定所有类型的scRNA-seq定量了。更多帮助见官方文档。
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