细胞周期，即细胞生长和分裂的过程，是基本的生命进程。它是由基因和蛋白在时间和空间上的精确调控驱动的，一旦失调将会带来毁灭性的后果，如癌症。到目前为止，还没有针对细胞周期过程中细胞间蛋白质组学差异的系统研究。2021年2月，瑞典皇家理工学院的Emma Lundberg教授团队通过整合亚细胞水平的蛋白质组学、单细胞转录组学和细胞周期中单细胞水平基因和蛋白表达的精确时间测量，提出了一个全面的、时空维度的人类蛋白质组学异质性图谱。研究结果整合到HPA（Human Protein Atlas）数据库中，为人类细胞周期和细胞增殖的分子研究提供了参考。

研究结果：

1 单细胞的蛋白质组学异质性

本文对HPA数据库中的12390个蛋白图像数据进行分析发现，其中2292个（18%）显示出同一种细胞间在表达水平和空间分布的异质性。图1A显示，CCNB1，一种细胞周期调节因子，其细胞间丰度存在差异；而HMGSC1，其表达在细胞核和胞质之间存在丰度和空间定位的差异。2292种蛋白中，66%表现出不同细胞类型间的异质性，如图1B所示。表明这些蛋白质组变化可能是由保守的调节机制控制。

2. 有丝分裂期的蛋白

一个蛋白如果定位于有丝分裂结构中，则它必然直接参与细胞周期活动中。本研究显示有230种蛋白定位于一个或多个有丝分裂结构中（图1D），其中99个是之前未发现的，如胞质分裂桥中的C12orf66和DUSP11，有丝分裂染色体上的BMS1，有丝分裂纺锤体上的TAF1D和FKBPL等蛋白。

3.分裂间期的单细胞蛋白基因组学

为了确定观察到的细胞间差异是否与间期进展相关，作者使用FUCCI U-2 OS细胞进行了靶向单细胞成像蛋白基因组学分析(图1E)。2292个细胞间差异蛋白中有1219个均在U-2 OS细胞中表达，利用免疫荧光对蛋白定位和丰度进行深入分析发现，这些蛋白表达的平均差异倍数（fold change）为6.89。结果显示：一些细胞周期调节因子，如ANLN，在细胞间期进程中核丰度增加；有的蛋白如TRNT1和NFAT5，则未显示明显的变化（图1F）。

图1  利用成像技术进行单细胞蛋白质基因组学分析

4. 与细胞间期相关的蛋白

基于上述研究发现321个细胞间差异蛋白与细胞周期间期进展相关（ 图2A），与细胞周期依赖（CCD）蛋白对应的基因在GO分析中显著富集于细胞分裂（图2B）的生物学过程。有趣的是，与非CCD蛋白对应的基因在任何GO生物过程中都没有富集。当将GO富集分析限制为酶时，非CCD蛋白中与基本代谢功能（如ATP生成）或整个代谢途径（如糖酵解）相关的通路得到富集（图2C）。这些结果表明，鉴定到的CCD蛋白确实参与了细胞周期过程，而与细胞周期无关的蛋白可能参与了包括代谢在内的各种不同的生物过程。亚细胞定位结果发现CCD和非CCD蛋白的定位存在显著差异(图2D)。非CCD蛋白定位在中间丝、核仁、核体和线粒体，而CCD蛋白定位于核仁和有丝分裂结构中。

5. 细胞周期蛋白网络的扩展

为了研究新的CCD蛋白是否与已知的细胞周期蛋白相关联，作者使用STRING数据库分析了蛋白-蛋白相互作用，结果显示新发现的CCD蛋白参与了已知CCD蛋白相关的生物学过程。已知的CCD蛋白(通常在转录水平调控)紧密聚集在网络的核心，而新发现的CCD蛋白形成了一个扩展的网络(图2E-F)。

图 2  发现新的CCD蛋白及相互作用网络分析

6. 细胞周期中转录组和蛋白质组的时间动态

作者对细胞周期中RNA和蛋白表达时间进行了精确测量，发现大多数RNA在G1期达到峰值，而75%的蛋白质在S期和G2期达到峰值(图3B、3C)。对50个CCD蛋白分析发现，蛋白表达平均峰值比RNA延迟7.7小时（图3D）。这是第一次报道单细胞水平上转录组和蛋白质组表达的时间差异。

7. PTM与循环蛋白的稳定性

PTM对细胞周期信号传导很重要，本文利用U-2 OS细胞的磷酸化蛋白质组学质谱数据分析了PTM的丰度。分析发现，相对于所有PTM的平均值，CCD蛋白上的PTM位点更多（图3E），表明CCD蛋白具有更加严格的PTMs调控。而受转录周期调控的蛋白PTM位点较平均值低，表明这些蛋白的PTMs调控较宽松，在转录调控中发挥着更大的作用。蛋白质降解在细胞周期中也起着重要作用，本研究发现受转录调控的CCD蛋白稳定性明显低于非转录调控CCD蛋白（图3F），表明通过这些蛋白降解来实现细胞周期的不同蛋白表达。

图 3  细胞周期相关的蛋白质基因组及PTM差异分析

8. 细胞周期蛋白的时空分布

通过蛋白表达时间的对比分析，可以获得与已知的细胞周期蛋白具有高度相似模式的新的细胞周期蛋白，如本文新发现的ZNF32蛋白，与已知的CCD蛋白ORC6的表达模式相似(图4A)，而ZNF32被认为与肺腺癌相关。脱氢酶UGDH是一种新的CCD蛋白质，免疫荧光和活细胞成像观察到，其在G1早期从胞浆转运到细胞核，随后，核丰度逐渐增加，直到G2期达到峰值（图4C)。此外，共同的亚细胞定位也是与已知的细胞周期蛋白相关联的另一个途径。如线粒体蛋白丙酮酸羧化酶(PC)在G2期(20.3小时)表达达到高峰，与TTC21B(19.1小时)具有相同的亚细胞位置和时间表达模式。通过这些信息，本文将新发现的和已知的细胞周期蛋白与细胞器(如胞浆、细胞核、核仁和高尔基体)中相似的时间分布关联起来，形成蛋白质的时空分布图。

图 4  细胞周期蛋白的时空分布

9 细胞周期蛋白与增殖相关

新的CCD蛋白在增殖组织中的基因表达明显高于非增殖组织，表明其对细胞增殖的重要性（图5A、5B），基因共表达网络分析发现，在所有癌症组织和正常增殖组织中，新的CCD基因到已知细胞周期基因的路径明显更短，而在低增殖组织和非增殖组织中，路径长度没有显著减少（图5C），也说明了新的CCD蛋白与细胞增殖相关。图5D显示，SiRNA使基因沉默后，导致了细胞增殖异常。CD2BP2在正常肝脏低表达，在肝脏肿瘤中高表达(图5E)，提示CD2BP2的表达促进细胞增殖。因此，这些新的CCD蛋白可能成为新的癌症诊断或治疗靶点。

图 5   新的CCD蛋白与增殖相关

小结

通过该研究发现，大约五分之一的人类蛋白质组显示了细胞间的差异性，同时鉴定到数百种以前未知的与有丝分裂和细胞周期相关的蛋白质，且其中部分具有致癌性。文章结果表明，只有26%的细胞间差异蛋白与细胞周期进程相关，而且大多数是在翻译后被调控的。本研究最大的亮点是通过基于抗体的蛋白数据结合转录组数据以及基于质谱的PTM数据，在单细胞水平上对细胞周期蛋白进行了时间和空间的描述，为人类细胞周期的研究、CCD蛋白质在肿瘤发生中的作用，以及细胞增殖的新临床标志物的鉴定方面提供重要的资源。

参考文献

Diana Mahdessian, Anthony J. Cesnik, Christian Gnann, et al. Spatiotemporal dissection of the cell cycle with single-cell proteogenomics[J].Nature. 2021，590(7847):649-654.