导语：外泌体研究与应用已经渗透到多个领域，在医学方向（肿瘤、免疫、神经、心血管、糖尿病等）、农学方向（植物、微生物）以及工业化方向（靶向药物递送、美容制品）的研究成果更是层出不穷。诺禾致源外泌体测序产品结合自身平台优势，提供外泌体富集、鉴定、测序、多组学生信分析、个性化分析作图、售后云平台一系列服务，利用全面技术手段、多样化测序平台助力外泌体研究。
外泌体概念与特征
外泌体是由细胞质中产生、经细胞膜释放，直径在30~150 nm之间，携带有母细胞的多种蛋白质、脂类和核酸等物质的一种外囊泡结构。其来源丰富多样，广泛存在于血浆/血清／脑脊液／尿液／乳汁／唾液／精浆／胸腹水等体液及细胞上清中。随着研究的深入，植物、微生物等物种以及牛奶啤酒等制品中均有发现。
外泌体功能及应用
外泌体功能：
1）参与免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结等生物学过程；2）宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与肿瘤发生、生长、侵袭和转移等过程，是细胞间信号传递的主要媒介；3）可以作为重要的靶向药物载体；4）含丰富的生物标志物。
外泌体应用：
外泌体中携带的非编码ncRNA与编码mRNA，以及蛋白质等信息在细胞间信息传递、调控基因表达等方面有着重要作用。对外泌体内容物进行研究能够深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制，而且筛选外泌体特异biomarker也有着非常高的临床应用价值[1]。
外泌体富集鉴定方法介绍
针对不同样本类型、不同研究目的、不同样本量，需要采取不同的外泌体富集方式，单一型富集方式远远不能满足研究需求。诺禾致源提供富集方式与鉴定手段详见下图：
外泌体鉴定分为三个部分，电镜鉴定主要采用冷冻透射电镜（TEM）；粒径检测有两种方法可供选择：NTA和纳米流式，纳米流式的原理是颗粒大小不同散光不同，NTA对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析进而计算浓度和直径；表面标志物蛋白的检测主要有两种方式——western-blot和纳米流式。纳米流式检测表面标志蛋白在国外应用较为广泛，凭借其检测量低灵敏度高、精准度高假阳性低、能够定量的优势逐渐成为表面标志蛋白的主流手段。目前，诺禾致源纳米流式蛋白检测主要针对于人/大小鼠，其他物种抗体需要单独评估。
鉴定结果展示：
图1 外泌体鉴定（左一电镜，蓝色框粒径，绿色框表面蛋白检测）
外泌体转录组学
外泌体主要内容物之一的RNA包括非编码RNA（smallRNA、lncRNA、circRNA）与编码RNA（mRNA），它们在细胞间起着信息传递、调控基因表达的重要作用；以其自身能够被扩增、占比高的优势，在外泌体内容物研究、功能探索研究中热度居高不下，占据主导地位。诺禾致源外泌体转录组学所提供的测序服务详见下图。
另外，smallRNA由多种小RNA组成，包括miRNA、piRNA、tsRNA、YRNA等等，它们各自发挥着不同的功能。根据自身课题研究的需要，有选择性的研究不同类型的小RNA，实现一库多分析；搭配多种疾病/癌症等特色数据库注释，也是诺禾致源外泌体转录组学产品的特色之一。
外泌体蛋白质组学
蛋白质是功能的执行者。应用蛋白质组学技术，不仅能够更加直观的解释表型变化，亦可作为转录组与表型之间的纽带深入解析生物分子功能和调控机制。随着质谱技术的不断革新，外泌体蛋白质组学研究也取得了突破性进展，在Nature、Cell等国际顶级期刊均报道了外泌体蛋白质组学在机体先天免疫、疾病标志物筛选和药物靶点的研究成果。
组学关联分析
诺禾致源外泌体生信分析主要涉及编码/非编码转录组学、蛋白质组学及二者关联分析，具体分析内容见下图：
除转录组学与蛋白组学鉴定、定量、差异、基因/靶基因/来源基因功能富集等经典的生信分析内容外，依据不同RNA各自的功能特性开发的ceRNA、WTS（基于差异）网络能够进一步诠释相互作用机制；结合蛋白层面的数据，从功能、表达水平两个层面挖掘共有点或者特有点如今也成为多组学关联分析的一大趋势。另外，翻译组（Ribo-seq）为RNA与蛋白之间的桥梁，利用好翻译组辅助验证ncRNA的翻译潜能或者mRNA的翻译效率，能够进一步诠释组学之间的关联性，深入解决生物学问题。
多组学文献思路设计解析
文献一：口服牛奶来源的细胞外囊泡诱导原发肿瘤衰老但会加速癌症转移[2]
牛奶含有携带丰富RNA和蛋白质货物的EV，可以在体外被人和鼠肠道上皮细胞吸收。该研究从生牛乳和商业牛乳中分离EV，并通过电子显微镜、纳米颗粒追踪分析、蛋白质印迹、定量蛋白质组学和小RNA测序分析对其进行表征，评估它们在跨物种交流中的作用。结果表明，口服牛奶来源的EV能够抵抗肠道的恶劣环境，并在包括肝脏在内的许多小鼠器官中具有生物利用度。蛋白质组学和生化分析揭示了乳源性EVs对癌细胞衰老和上皮-间充质转化的诱导作用。摄入乳源性EV可减少原发肿瘤的生长并减轻癌症引起的体重减轻。尽管原发肿瘤大小减小，但促进了癌症转移；另外，原发肿瘤是乳源EV诱导癌症转移的关键，实验证明，切除原发肿瘤之后再口服乳源EV，相对口服PBS组明显降低了癌症转移的发生。这些结果强调了牛奶来源的细胞外囊泡在跨物种交流中的作用及其在调节癌症进展和转移中依赖于囊泡内容物的作用。
图2 牛奶来源的EVs诱导原发肿瘤衰老加速癌症转移思路
文献二：心外膜细胞外囊泡促进心房颤动 [3]
异常的心外膜脂肪（eFat）是促炎和纤维化因子的重要来源，可诱发心房肌病和房颤（AF）。并且，eFat分泌的细胞外囊泡（EVs）携带促炎、促纤维化和促心律失常分子。本研究收集AF患者和非AF患者eFat组织，并通过体外培养收集培养基用于分离纯化EVs，进行蛋白质组学和miRNA测序分析。首次显示房颤患者的eFat-EVs具有独特的促炎、促纤维化和促心律失常特征，揭示了eFat促进心房肌病和房颤发展的另一条途径，有助于发现预防和治疗房颤的新诊断标志物和新靶点。
图3 蛋白质组学和miRNA测序揭示心外膜细胞外囊泡促进心房颤动机制
总结以上两篇推文，外泌体多组学思路大致可以归纳如下：
多组学生信分析内容
转录组和蛋白质组表达调控分析
将转录组信息，与蛋白质组信息进行整合，找出对应关系，绘制韦恩图。
转录组和蛋白质组表达量关联分析
将转录组和蛋白质组共同鉴定出的基因(蛋白质)在两个组学中的差异倍数进行相关性分析。
功能关联
将转录组和蛋白质组两方面进行GO 富集分析和KEGG富集分析，结果进行比较，可以分析两组学功能富集的差异和共同点。
参考文献
[1] Kalluri, R., LeBleu V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science, 2020, 367, 640.
[2] Samuel M., Fonseka P., Sanwlani R., et al. Oral administration of bovine milk-derived extracellular vesicles induces senescence in the primary tumor but accelerates cancer metastasis[J]. Nat Commun. 2021. 24;12(1):3950.
[3] Shaihov-Teper O., Ram E., Ballan N., et al. Extracellular vesicles from epicardial fat facilitate atrial fibrillation[J]. Circulation. 2021. 22;143(25):2475-2493.
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