期刊：Journal of Hazardous Materials
影响因子：10.588
发表时间：2022
样本类型：枯草芽孢杆菌
客户单位：中国科学院合肥物质科学研究院
一、研究背景
天然硒中毒性最大的是亚硒酸盐 [Se(IV)]，微生物对Se(IV) 的生物转化是一种有效的解毒和同化过程。目前研究的大多数纳米硒合成菌株是革兰氏阴性菌，其外膜含有脂多糖（LPS），这使得这些细胞特别容易粘附在 SeNPs 上，从而阻止了它们的进一步利用。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，可在有氧条件下将 Se(IV) 还原为硒纳米颗粒（SeNPs），目前关于枯草芽孢杆菌还原亚硒酸盐的分子机制的知识仍然有限。本研究提供了枯草芽孢杆菌 168 中Se(IV) 还原的多途径模型，从而为Se(IV) 生物还原形成 SeNPs 的分子机制提供了新的见解。
二、实验设计
抗生素处理的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有氧培养后，接种到含有或不含有
Na2SeO3的LB培养基中，来证明枯草芽孢杆菌是否对 Se(IV) 的还原作用，并通过 SEM 和 FTIR 光谱进行了的eNPs 定位和表征。通过转录组和基因敲除与回补，详细描述了硒纳米颗粒 (SeNPs) 形成的分子机制。
图 实验流程示意图
三、实验结果
1、枯草芽孢杆菌将 Se(IV) 还原为 SeNPs
当添加Se(IV) 时，LB培养皿中枯草芽孢杆菌菌落变红，表明产生了 SeNPs（图1）。根据生长曲线测量元素硒的形成，以进一步证实枯草芽孢杆菌对Se(IV) 的还原伴随着 SeNPs 的产生（图2）。当细菌生长达到一个平台期时Se(IV) 没有被还原，这表明Se(IV) 的还原主要发生在细菌生长的初始阶段。
图 1 枯草芽孢杆菌在LB 中生长培养
图 2 枯草芽孢杆菌生长、Se(0) 形成和SeO32-去除的时间进程
2、SeNPs 在枯草芽孢杆菌中的定位和表征
TEM 确定了球形纳米颗粒在细胞外的位置，显示了枯草芽孢杆菌细胞和产生的 SeNPs，在没有添加Se(IV) 的细菌培养物中没有观察到 SeNPs 的合成（图1C、D）。此外，EDX用于进行元素分析，纳米粒子表现出与硒相关的特定峰（图3A、B）。利用FTIR 分析从细胞中提取 SeNPs 表明（图4），在枯草芽孢杆菌产生的 SeNPs 表面存在碳水化合物、蛋白质和脂质等有机残留物。
图 3 SeNPs 的位置与特征信息
图 4 从枯草芽孢杆菌中纯化的 SeNPs 的 FTIR 光谱
3、转录数据分析结果
作者通过转录组学方法研究了亚硒酸钠处理前后的枯草芽孢杆菌细胞的基因调控，与对照组相比，亚硒酸钠处理组共鉴定出 2176 个 DEGs，其中上调 994 个，下调 1182 个（图 5A）。根据GO和KEGG注释，鉴定出的DEGs可分为19个功能组（图5B），29条KEGG通路显著富集（图5C）。Se(IV) 处理组显著富集的途径包括丙酮酸代谢、不同环境下的微生物代谢、磷酸戊糖途径、脯氨酸代谢和核黄素代谢等。
图 5 不含和含硒(IV)的枯草芽孢杆菌的转录组分析
4、参与Se(IV) 还原的主要基因
在分析与 Se(IV) 还原相关的基因时，研究发现 putC（编码 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase）、gabD（编码琥珀酸-半醛脱氢酶）和 cysJI（编码亚硫酸还原酶）在 Se(IV) 处理组中显著上调。对照组和处理组的转录组数据的分析表明，脯氨酸代谢、谷氨酸代谢和亚硫酸盐代谢途径基因的表达是由Se(IV) 诱导的，表明Se(IV) 通过多种代谢途径被还原为元素硒。
为了确定 Se(IV) 减少是否由枯草芽孢杆菌的 putC、gabD和 cysJI介导，构建了三个基因敲除和回补菌株。在测量总细胞蛋白含量后，未发现菌株之间的生长差异（图6）。该结果表明PutC、GabD和CysJI介导了Se(IV)的还原，这些过程也导致了基因敲除菌株中Se(IV)的还原减少（图6）。破坏一种途径并不能完全抑制枯草芽孢杆菌中 Se(IV) 的还原，Se(IV) 可通过两种途径减少：(1) 脯氨酸代谢途径和 (2) 亚硫酸盐代谢途径。
研究发现大多数SeNPs存在于细胞外，而在细胞内只发现了少数SeNPs，Se(IV) 还原不仅发生在细胞中，还发生在细胞表面。Se0很可能由细胞内的 PutC、gabD和 cysJI 脱氢酶系统合成，然后通过细胞膜上的转运系统分泌到细胞外形成 SeNPs。
图 6 芽孢杆菌(WT)、ΔcysJI(突变株)、ΔcysJI-C(互补株)、ΔputC(突变株)、ΔputC-C(互补株)、ΔgabD(突变株) 和ΔgabD-C（互补菌株）的生长曲线和还原曲线
5、PutC、GabD 和 CysJI 对 Se(IV) 还原的作用
PutC、GabD 和 CysJI 在大肠杆菌 BL21（pET28-putC、pET28-gabD、pET28-cysJ 和 pET28-cysI）中表达并纯化。根据 SDS-PAGE 和蛋白质序列分析，PutC、GabD、CysJ 和 CysI 的分子量分别为 56.4、50.3、67.2 和 64.8 kDa。通过纯化的 PutC、GabD 和 CysJI 将 Se(IV) 还原为 Se(0)，在管底部产生红色沉淀。在 NADPH 的对照培养物中，Se(IV) 没有减少。PutC、GabD 和 CysJI 的最适温度为 37 ℃。CysJI、GabD、PutC 的最适 pH 值分别为 7、7 和 8（图 7）。
图 7 CysJI 、PutC、GabD的体外活性
图 8 枯草芽孢杆菌 168 Se(IV) 还原机理及示意图
四、研究结论
微生物对Se(IV) 的还原可以通过多种机制发生，包括（I）脯氨酸代谢途径和（II）亚硫酸盐代谢途径，细菌具有复杂的稳态机制来适应环境中的硒。本研究首次证明了 PutC 和 GabD 在亚硒酸盐还原中的作用。特别是，本研究结果表明，Se(IV) 的减少是由体内和体外的多种途径介导的。因此，本文研究结果为需氧细菌中 Se(VI) 还原的分子机制提供了新的见解。
参考文献
Novel mechanisms of selenite reduction in Bacillus subtilis 168：Confirmation of multiple-pathway mediated remediation based on transcriptome analysis. Journal of Hazardous Materials, 2022.
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