文献学习027--[sc]组织环境对中性粒细胞命运的共同决定作用

最近对中性粒细胞感兴趣，就多读了几篇文章。分享的这一篇是20年的cell。

Highlights

• Neutrophils have variable lifetimes in tissues
• Neutrophils acquire distinct phenotypic and functional
  properties in tissues
• Tissue-derived signals drive rapid adaptation of neutrophils
• Neutrophil reprogramming in the lungs occurs in CXCL12⁺ niches.

髓系白细胞的一个基本特性是接受不同的环境信号会表现出转录和功能上的可塑性¹。这种可塑性已在病理或稳态条件下得到证明，重要的表现是具有组织特异性的表型和转录谱²。（这一点让我想起之前分享的一篇nature：结构细胞是器官特异性免疫反应的关键调节者，不同组织的同类结构细胞间的转录差异比同一器官的不同结构细胞之前的差异还要大）在髓系白细胞中，大部分对组织相关特征的研究都聚焦在巨噬细胞上，对中性粒细胞（髓系白细胞中丰度最高的细胞）的研究则相对较少，很大程度上是由于中性粒细胞在循环中的生命周期较短、组织环境遗传适应的转录活性较低。然而，越来越多的证据表明，在不同的疾病中中性粒细胞的转录谱表现出强烈的异质性^3,4。因此，健康组织中也可能存在不同的中性粒细胞亚群，以适应这些组织的特定环境，完成这些组织所需的机体生理任务。
该研究聚焦了组织中中性粒细胞的多样化特性。发现中性粒细胞在多种组织中具有较长的生命周期，有助于细胞适应组织环境（蛋白组、转录组和表观遗传学分析确定了中性粒细胞的表型和功能）。这些研究使得我们可以鉴定出中性粒细胞的非经典功能，并发现在肺部，组织特异性编程使得趋化因子能够引导中性粒细胞至定位区域，以维持器官稳态和生理需求。

1. Short and Variable Lifetimes of Neutrophils in Tissues

小鼠循环中的中性粒细胞存活时间大概是12h，但是中性粒在组织的存活时间是未知的。
Fig 1A：作者使用共生鼠探究了组织中性粒的存活时间。将共生鼠分开，在分离了parabiotic partner后检测了各组织中起源于partner鼠的中性粒。发现除了骨髓以外，其他组织的中性粒都出现了快速下降，在肺和脾中1d下降至平台期，在血液和肝脏中4d下降至平台期。（手术损伤可能延长了中性粒的半衰期，而且LysM是myeloid cell lineage共有的，不能完全代表中性粒。参考：LysMcre）
Fig 1B：为了更精确的检测组织中中性粒细胞的生存时间并排除手术操作引起炎症反应的影响，作者构建了Ly6G^CreERT小鼠，和Rosa26-LSL-tdTomato reporter line杂交，得到iLy6G^tdTom中性粒细胞示踪鼠。
给了tamoxifen之后，重组tdTomato⁺中性粒细胞在d2时在骨髓中出现，1d之后在其他器官组织包括血肝肺脾小肠和皮肤中出现。为了计算从各组织中tdTomato⁺中性粒细胞达到peak的时间开始的中性粒细胞消失率，作者构建了一个mathematical model。发现不同组织中性粒细胞的half-lives不同，最短的是肝脏(8.71 h)，最长的是皮肤(18.4 h)，血液在～10h。

这些结果提示中性粒细胞到达组织后并不马上出现死亡，而是会在组织存在一段时间。
Fig 1C：使用示踪鼠探究了中性粒细胞的来源，发现与其它髓系细胞比如巨噬和肥大细胞可能由胚胎前体细胞起源不同，中性粒细胞是完全的骨髓造血来源。胚胎Ly6G⁺前体细胞不会发育为组织long-lived中性粒细胞。

2. Tissue-Associated Profiles of Neutrophils Identified by Single-Cell Analyses

前面的结果中，作者在数十小时的时间范围内观测了组织中中性粒细胞的存在时间，发现它们在每个circadian cycle中存在连续的波动，因此作者推测中性粒可能在不同组织中获得了不同的特征。
Fig 2A：作者使用39个抗体对骨髓，血，脾脏，肺脏，小肠和皮肤的白细胞进行了质谱流式分析。
Fig 2B：可以看到，不同组织的巨噬细胞存在最大的异质性，不同器官之间的巨噬细胞独立成群，和既往的报道是一致的。中性粒细胞也呈现出cluster-to-tissue分布。单核细胞，B细胞和NK细胞则异质性较小。
Fig 2C：不同组织的巨噬和中性粒细胞存在较大异质性
Fig 2D：血，肺，骨髓中性粒存在distinct clusters，小肠和皮肤的中性粒比较类似，脾脏的中性粒则是骨髓和肺的overlap。
Fig 2E：使用39个抗体从蛋白水平检测的质谱流式得到的信息有限，为了进一步验证前面的结论，作者提取了不同组织的中性粒细胞，进行了单细胞测序。由于皮肤和小肠的中性粒提取和制备困难（质谱流式做的是白细胞，也可以看到皮肤和小肠的中性粒细胞很少），作者只对骨髓，血液，肺和脾脏的中性粒进行了分析。一共得到了7490个中性粒细胞，其中6800来自骨髓，380来自脾脏，264来自血液，147来自肺脏。
Fig S2F：7490个中性粒聚成了5个cluster。0，1和2群主要在骨髓和脾脏中富集，3群主要是血的，4群主要是肺的。
Fig 2F, S2J-M：成熟相关marker基因表达和拟时序结果提示中性粒细胞存在一个连续的从骨髓/脾--血--肺的cell-state transition。

Fig 2 Fig S2

3. Transcriptional and Chromatin Adaptations of Tissue- Infiltrating Neutrophils

Fig 3A：为了进一步探究中性粒细胞的异质性并进行更深一步的转录分析，作者分离了小鼠骨髓，血液，脾脏，肺，小肠和皮肤的中性粒进行了bulk RNAseq（肝的中性粒细胞活性差）。和单细胞的数据一致，不同器官的中性粒具有较大的转录差异。
Fig 3B：UpSet图提示组织间的转录interaction很弱，其中肺和小肠的中性粒细胞share了最多的transcripts，皮肤和小肠之间的差异则最大。
Fig 3C：把bulk RNAseq投射到scRNAseq的数据上，一致性也比较好，组织特异性明显。
Altogether, these data indicated that neutrophils acquire transcriptional properties associated with the tissues that they infiltrate in the steady state.

前面的数据是质谱流式（蛋白层面）+ scRNAseq和bulk RNAseq（转录层面），所以作者想要进一步去探究表观层面是否也有一致性的变化。
Fig 3D：作者对骨髓，血，脾，肺的中性粒细胞做了ATAC-seq，对accessible regions的PCA分析结果提示不同组织具有很大的差异。
Fig 3E：前面Fig2提示中性粒细胞存在一个连续的从骨髓/脾--血--肺的cell-state transition，作者比较了骨髓和血，血和脾，血和肺的accessible chromatin的变化。和之前报道的一致，骨髓/脾--血出现了很明显的变化。但是在血--肺也出现了明显变化，提示中性粒从血液进入组织也存在着明显的chromatin modifications。
Fig 3F：对differentially open regions进行k-means聚类鉴定出了4个clusters。（with similar patterns at key neutrophil gene loci such as S100a8 and S100a9 across tissues）。cluster1和3与肺中性粒细胞染色质区域可及性改变有关(C1 down, C3 up)。cluster2包含血中性粒细胞可及性增加的区域。cluster4富集的区域主要与脾脏中性粒有关。
重要的是，每个cluster中的affected regions相关的基因在bulk RNAseq中也被检测到(Fig 3A, F)
Fig 3G：cluster 3中包含的open chromatin regions在单细胞数据集中投射在肺的cluster中
Fig 3H I：染色质和转录组的变化和蛋白改变是相一致的

Altogether, these data identified remarkable heterogeneity on neutrophils under steady-state conditions at the chromatin, RNA, and protein levels. They also implied that neutrophil diversity is not only the consequence of medullary maturation, as their phenotypic and transcriptional diversity was further tuned when neutrophils entered peripheral tissues.

4. Neutrophil Fates Are Imprinted in Tissues

巨噬细胞的组织异质性是在组织中长时间驻留和暴露在局部微环境的结果^5, 6^。但是中性粒细胞在组织存活时间非常短，因此中性粒细胞获得组织特异性的原因可能与巨噬细胞不同。
Fig 4A：为了探究中性粒细胞组织特异性的潜在来源，也就是探究组织中性粒的转录模式是否已经存在于循环细胞，作者首先将每个组织的特征投射到血液中性粒细胞的单细胞转录组上，发现血液组织的特征是最强的。但是血液的细胞却没有展示出脾脏，肺脏，小肠和皮肤中性粒的特征。
bulkRNAseq数据显示肺、小肠和皮肤的中性粒转录组更加多样化，骨髓、血液和脾脏的中性粒则相对更相似。推测可能是屏障组织受到自然暴露的共生微生物群的影响。
Fig 4B：作者检测了无菌小鼠血、脾和肺的中性粒。发现和普通小鼠的中性粒没有明显差异，但是无菌小鼠的肠道和皮肤几乎没有中性粒细胞，证明了作者前面的猜想。
但肺和脾脏的中性粒细胞又是如何形成组织特征的？
Fig 4C-D：作者对异种共生模型鼠不同组织的中性粒进行了质谱流式检测（区分时host derived还是血液derived），发现不同来源的中性粒在组织中具有很高的相似性，suggesting that specification of neutrophil signatures occurred in tissues.
Fig 4E-F：对中性粒进行组织转移实验，发现转移到组织的中性粒具有了组织特征。同时结合肺在病理状态下的特征对中性粒细胞进行检测，最终得出结论：中性粒细胞在进入组织后发生重编程。

5. Angiogenic Properties of Neutrophils in the Lung and Intestine

接下来，作者利用中性粒细胞的损耗模型证明了中性粒细胞支持基因毒性损伤后的造血修复和维持造血稳态。此外，肺部的所有白细胞中，只有中性粒细胞展现出了肺部特异性的特征，基因表达谱和动物实验显示具有促进血管生成的特性和功能，该功能在小肠中也有所体现。

6. CXCR4 Guides Neutrophils to Sites of Tissue Specification in the Lung

最后，作者利用中性粒细胞特异性缺失CXCR4的小鼠模型证明了CXCR4不影响肺部中性粒细胞的转录谱特征，而是引导中性粒细胞定位到获得其表型和行使功能的特定区域。

总的来说，本研究利用新的模型来追踪中性粒细胞的命运，发现其在不同组织的寿命较短且各不相同。通过对蛋白质、转录组和染色质可及性图谱分析，识别了不同的中性粒细胞的表型和功能。中性粒细胞的损耗对血管生成过程造成损伤，进一步支持中性粒细胞有助于基因毒性损伤、病毒感染以及辐照后造血系统的损伤修复。此外，对于肺部和小肠，中性粒细胞在组织中才获得了组织特异性，且肺部的的中性粒细胞定位于富含CXCL12的区域，依赖于CXCR4。该研究证明了组织中存在不同的中性粒细胞亚群，其命运决定于组织环境，具有适应和完成这些组织所需的机体生理任务。

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参考文献：

1. Natoli, G., and Ostuni, R. (2019). Adaptationand memory in immune responses. Nat Immunol 20, 783–792.
2. Lavin, Y., Mortha, A., Rahman, A., and Merad, M.(2015). Regulation of macrophage development and function in peripheraltissues. Nat Rev Immunol 15, 731–744.
3. Cuartero, M.I., Ballesteros, I., Moraga, A., Nombela,F., Vivancos, J., Hamilton, J.A., Corbı´, A.L., Lizasoain, I., and Moro, M.A.(2013). N2 neutrophils, novel players in brain inflammation after stroke:modulation by the PPARg agonist rosiglitazone. Stroke 44, 3498–3508.
4. Gupta, S., and Kaplan, M.J. (2016). The role of neutrophils and NETosis in autoimmune and renal diseases. Nat Rev Nephrol 12,402–413.
5. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell 159, 1327–1340.
6. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell 159, 1312–1326.