10x单细胞

发表在2018年9月的NC, 文章是：Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA 两例免疫治疗患者，在一位患者身上发现了规律，在另一位患者身上得到了证实。取患者血液和肿瘤，做免疫组化、分选、exome-seq、single cell RNA-seq、qPCR。

两个病人分别是：

The primary patient (2586-4) received hypofractionated radiation for HLA upregulation to some but not all disease sites:

The second validation patient (9245-3) is a 59-year-old man with metastatic MCC that had initially presented as stage IIIB disease, now metastatic at multiple sites.

有4个时间节点非常重要：

pre-treatment

early post treatment day+27,

responding post treatment day + 37

relapse/acquired resistance post treatment day + 614

如下所示：

最重要的应该是10个单细胞转录组样本的数据分析部分。

关于 Merkel cell carcinoma (MCC) ，本研究的两个病人都是转移性梅克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma,MCC)患者，Merkel细胞癌（MCC）是一种罕见但极具侵袭性的癌症，据估计，疾病相关死亡率高达46%。研究已证实，MCC是一种免疫反应性疾病，免疫检查点抑制剂的问世改变了晚期MCC患者的治疗现状。所以本研究价值非常大。

单细胞转录组测序数据

首先是：Gene expression analysis: discovery patient tumor，用的是 10x genomics 3’ Chromium expression assay

Following sequence alignment and filtering, a total of 7431 tumor cells (2243 cells before and 5188 cells after T cell therapy 分3个时间点 were analyzed.

然后是：Gene expression analysis: discovery patient PBMC，用的是 10x genomics 3’ Chromium expression assay，Following sequence alignment and filtering, a total of 12,874 cells were analyzed.

数据在：GSE117988

| ID | description |

| —————————————————————————————— | ——————— |

| GSM3330559 | Tumor Disc Pre |

| GSM3330560 | Tumor Disc AR |

| GSM3330561 | PBMC Pre |

| GSM3330562 | PBMC Disc Early |

| GSM3330563 | PBMC Disc Resp |

| GSM3330564 | PBMC Disc AR |

最后是另外一个病人：Gene expression analysis: validation patient，用的是 10x Genomics 5’ V(D)J 平台测序

The aggregated corrected-normalized gene-barcode matrix was used to first run PCA and t-distributed stochastic neighbor embedding (tSNE) analyses.

数据在： GSE118056

| ID | description |

| —————————————————————————————— | —————————— |

| GSM3317833 | PBMC Relapse - L001 |

| GSM3317834 | PBMC Relapse - L002 |

| GSM3317835 | Tumor Relapse - L001 |

| GSM3317836 | Tumor Relapse - L002 |

而且数据处理代码都上传了：Supplementary Data 3.

第一个病人的4个时间点的PBMC细胞分群情况

全部细胞整合分群如下：

4个时间点分开分群如下：

这样就看到了规律，其中 CD8+ “red” activated cluster 非常重要：

同样是CD8阳性的T细胞，很明显这两个群细胞作用不一样，所以作者把 那个 376天复发的单细胞转录组数据里面的 red activated cluster (n = 170) to those in the blue effector/EM cluster (n = 429) 进行差异分析，得到热图 如下：

肿瘤部位单细胞转录组测序分析结果

前面我们介绍到这两个病人的PBMC是有4个时间点，但是肿瘤组织测序，只有治疗前后两个时间点。第一个病人的肿瘤组织单细胞转录组数据分类如下：

可以看到肿瘤组织里面的肿瘤细胞比例非常高，这个也很正常，比较纯的肿瘤，但是，很明显原位癌样品和复发的样品差异很大。

关注原位癌样品和复发的差异分析结果：

可以看到，复发样品的HLA-B基因表达量显著降低，所以继续可视化：

也是为了说明HLA-B基因表达量被抑制。

在另外一个病人也看到同样的情况，这个时候是HLA-A基因的表达量降低：

外显子测序数据

文章并没有费力描述病人的外显子数据分析结果，使用的是 Agilent SureSelect Human All Exon V6 芯片，和 illumina HiSeq 2500 测序仪。