ChIP-seq和CUT&Tag技术

作者: Ann_0822 | 来源:发表于2020-02-03 19:33 被阅读0次

    ChIP-seq:利用染色质免疫共沉淀 + 高通量测序研究某种蛋白质结合的基因组区域

    染色质由DNA、组蛋白等组成: 1.png DNA将组蛋白“打包”,起到调控基因比如激活/沉默的作用: 2.png

    1. 甲醛交联:将所有蛋白和其结合的DNA固定下来

    包括目标蛋白: 3.png 还包括其它蛋白: 4.png

    2. 染色质片段化:裂解细胞、DNA超声打断成小片段(~300bp)

    3. 免疫共沉淀:利目标蛋白对应的抗体,吸附我们想要的片段形成抗体-蛋白-DNA复合物,洗脱不想要的

    4. 目标片段富集:将抗体-蛋白从DNA上解离下来,洗脱抗体-蛋白,获得DNA片段

    5.png 6.png

    5. 文库构建:测序

    A. DNA两端加adaptor
    B. PCR扩增
    C. 检查library concentration
    D. 测序

    6. 数据质控+比对到参考基因组

    最后得到reads比对到参考基因组x号染色题xx-xx位置 7.png

    7. 确定peaks

    第一行:参考基因组
    第二行:样本reads覆盖情况
    第三行:control reads覆盖情况

    8.png
    control样本很重要:在同一实验中不使用任何抗体吸附DNA片段(用于排除背景噪音)

    参考:
    https://www.bilibili.com/video/av54898325?from=search&seid=16669728483429689132
    https://www.jianshu.com/p/a17f2870addd

    由于ChIP-Seq实验过程中的甲醛交联、染色质片段化、免疫共沉淀以及文库构建等步骤繁琐且条件难以控制,常规ChIP-Seq实验需要大量细胞,且实验重复性差、信噪比低。往往辛苦培养了很久的细胞,挥霍一空后得到大量难以分析的数据,再次实验又得到一堆不同的无意义数据,甚至一个技术熟练的博士消耗大半年的时间毫无进展。这些技术上的困难限制了ChIP-Seq在DPI研究中的进一步应用,阻碍了表观基因组等领域的发展。

    CUT&Tag技术

    前不久,弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公开了CUT&Tag技术的详细结果与实验方案。与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比,CUT&Tag技术方法简便易行,信噪比高,重复性好,需要的细胞数量少至60个细胞,且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平。

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    CUT&Tag技术的基本原理为:在抗体引导下,ChiTag酶仅在目的组蛋白修饰标志、转录因子或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的DNA的片段化,同时添加测序接头,并释放到细胞外。由于绝大部分无关的染色质还留在细胞核内,因此整个实验的信噪比大幅提高,同时简化了实验步骤。该方法可一管式高通量应用,并可与单细胞测序平台“无缝”结合。ChiTag酶在打断基因组的同时加上接头,不需要繁琐的补平加A加接头,在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程。

    CUT&Tag和ChIP-seq比较

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    和单细胞测序结合
    由于PCR之前的反应都在细胞内进行,Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序。

    11.jpeg

    https://www.nature.com/articles/s41467-019-09982-5
    https://www.sohu.com/a/331749726_120054289

    附:CUT&Tag 实验操作流程

    ConA磁珠沉淀细胞可用低速离心代替。低速离心指600 × g离心3min,快速离心指<100 × g离心3s。

    1. 细胞预处理(0.5-1h)
      1.1 室温下收集新鲜细胞置于EP管中并计数;低速离心,去溶液;
      1.2 管中加入细胞穿孔缓冲液重悬细胞;低速离心,去溶液;
      1.3 管中加入细胞穿孔缓冲液再重悬细胞,轻柔震荡并滴加Binding 缓冲液重悬的ConA磁珠,轻柔颠倒混匀5-10min;

    2. 一抗结合目的蛋白(2h)
      2.1 快速离心EP管,将管盖液体离心下来,将EP管静置于磁力架上沉淀细胞,去溶液。
      2.2 EP管中加入预冷的抗体缓冲液将细胞重悬,轻柔震荡后置于冰上;
      2.3 每管中加入0.5-1μl一抗(抗体使用生产商推荐浓度),轻柔震荡;
      2.4 室温下将EP管置于摇床上孵育2h;

    3. 二抗结合一抗(1h)
      3.1 快速离心EP管,将管盖液体离心下来,将EP管静置于磁力架沉淀细胞,去溶液。
      3.2 将二抗1:100稀释于穿孔缓冲液,加入管中,轻柔震荡;
      3.3 室温下将EP管置于摇床上孵育30-60min;
      3.4 快速离心细胞,将管盖液体离心下来,EP管静置于磁力架沉淀细胞,去溶液。
      3.5 管中加入0.8-1ml 穿孔缓冲液,上下颠倒10次;
      3.6 重复步骤3.4、3.5两次。

    4. ChiTag转座体结合抗体(1.5h)
      4.1 快速离心EP管,将管盖液体离心下来,将EP管静置于磁力架沉淀细胞,去溶液。
      4.2 将ChiTag转座体1:250稀释于穿孔缓冲液2中,并滴加于细胞上,轻柔震荡;
      4.3 室温下将EP管置于摇床上孵育1h;
      4.4 快速离心细胞,将管盖液体离心下来,将EP管静置于磁力架沉淀细胞,去溶液。
      4.5 管中加入0.8-1ml穿孔缓冲液2,上下颠倒10次;
      4.6 重复步骤4.4、4.5两次。

    5. 激活ChiTag转座体,片段化目的DNA(1h)
      5.1 快速离心EP管,将管盖液体离心下来,将EP管静置于磁力架沉淀细胞,去溶液。
      5.2 管中加入300μl ChiTag激活缓冲液,轻柔震荡;
      5.3 37ºC孵育1h。

    6. DNA提取(1h)

    7. PCR(1h),PCR之前需加入72ºC,5min步骤

    8. DNA纯化(30min)

    9. 上机测序

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