这周二组会期间。导师提起要将实验室所有构建的载体在Geneious里面统一管理。然后顺便问了一句是不是大家都会使用Geneious进行载体构建。然后提了一句，总不会有人的载体图谱是靠复制黏贴绘制的吧。我想说我就是那个不会操作的人，突然间发现自己就是拿着屠龙宝刀当砍柴刀用-暴殄天物啊！
作为一个老博士生，分子生物学最基础的载体构建都不会就有点说不过去了。于是我花了半天时间来摸索如何使用Geneious模拟实验条件下的载体构建。终于搞得七七八八了。废话少说，上菜！
这里我想将水稻OsNHX4连接到1300 35S-NeGFP载体NeGFP的后面。
待连接的片段及载体
我们知道对于融合蛋白载体的构建，主要是需要保证基因不能发生移码突变。我们查看载体，发现紧邻eGFP的Sac I 可以将载体进行线性化（整个载体中，Sac I 只有这一个酶切位点）。步骤是：>点击Cloning >Digest into fragments
Sac I将目标载体线性化
将载体线性化后，我们总共得到三个文件，当选中被线性化的载体序列放大后，我们能看到线性化载体的两端都有一个Sac I酶切后形成的overhang
Sac I 线性化载体形成overhang
由于在重组过程中，5‘-外切酶会将载体的粘性末端切除，为了好设计引物，在这里，我们需要重新把将要被切除的序列重新添加到Sac I前面并注释好。由于Sac I识别的位点是GAGCTC,而在载体上还存在一个G,因此我们需要补齐后面的5个碱基AGCTC，并保存好。
在Sac I overhang前面补齐AGACTC
接下来，选中目的基因及修改好的线性化的载体，并依次点击cloning ,再选择Gibson assembly
点击Gibson assembly之后，我们可以看到下面的界面，在这里需要设计两个地方：第一个是选择Backbone,即选择线性化的载体作为Backbone。其次需要将外切酶选为5‘-外切酶，然后再确定。
最后，重组载体就构建好了，并且会出现相应的重组载体，PCR扩增的引物以及一份报告。到这就大功告成了。点击重组的载体，你会发现这与你实际试验应该是吻合的。
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