现在构建载体系统的方法有很多，今天整理的一种是gateway系统去构建质粒载体系统，希望能够解决一下几个问题：
1：什么是gateway系统？
2：gateway系统包括几个反应，每个反应原理是什么？
3：在gateway系统中，反应的条件是什么？
4：如何得到最终的目的质粒？
5：和别的构建质粒的方法相比的话，它有何优势呢？
首先它在保持转录方向和ORF的前提下，目的基因的转移效率非常的高。
其次，可以表达多种DNA序列，比如PCR产物，cDNA克隆，限制性结构等。
第三，与传统的克隆方法相比,该技术不需要考虑目的DNA是否有合适的酶切位点,不需要进行酶切和连接反应,而是借助位点特异性重组,一旦获得入门克隆(Entry clone)后就能将目的DNA以正确的方向和读码框克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上(Destination vector),大大简化了基因克隆的步骤。
一：Gateway系统简介
Gateway克隆技术是由Invitrogen公司开发的基于λ噬菌体位点特异性重组原理进行基因克隆的一项新技术[1] 。
该技术可以将PCR产物或者是cDNA文库首先构建入门质粒，然后通过入门质粒，可以将目的基因转移到多种质粒载体里面进行表达和分析。（如图一）
Gateway示意图
二：Gateway系统的组成
一般来说，Gateway系统是由2个反应构成的，分别是BP反应和LR反应。那么什么如何通过BP反应和LR反应得到我们想要的目的质粒呢？
2.1 BP 重组：
这一步的目的是为了构建入门载体
通过设计引物进行PCR后，将目的基因两端都带上attB的序列，然后和donor 质粒进行反应，将ccdB基因置换了，得到entry clone质粒。
BP原理图
2.2 LR重组：
这一步是将入门质粒上的序列转移到目的质粒上，通过同源重组就可以实现。
LR 原理图
summary:
通过2次同源重组反应（ attB x attP / attL x attR ），就能得到目的质粒。
这里有个小问题，attB和attP的反应顺式连接和反式连接有关系吗？（换句话说如何排除正向插入引物和反向插入引物的情况？）
特异性的BP/LR反应
三：什么是donor质粒？如何设计引物？
一般来说常见的donor质粒有两种， pDONR™221 / pDONR™/Zeo。含有attP1/attP2的序列，只需要我们将含有attB1/attB2的目的序列和它进行重组反应就能得到入门质粒。
质粒图谱
3.1 那么如何获得含有attB1/attB2的序列的目的基因呢？
首先在设计引物的时候需要考虑到：
1： 序列是需要符合Gateway克隆的（需要含有attB序列）
2：是否是需要表达一些天然蛋白
3：PCR产物是否是需要和N- 、C-端的融合标签
在设计引物的需要遵循以下几个规则：
1：5‘端需要加上4个G
2：需要加上attB1的序列
3：基因特异性序列 18-25bp
3.1.1 Forward primer 设计
举个例子，F端引物设计有3个部分组成，你可能会好奇，NN是什么，这里NN有讲究，NN不能是AA,AG,GA否则就会变成终止密码子，导致后面的蛋白不表达了
F引物设计
举例：如果是设计N端融合蛋白的Forward Primer ，设计的时候注意终止密码子。
N- Forward 引物设计例子
3.1.2 Revrse primer设计
接下来看看Reverse 引物的设计要求
1：5‘端需要加上4个G
2：需要加上attB2的序列
3：基因特异性序列 18-25bp
4：如果要将PCR引物融合到C-端的tag上，必须得加上一个额外的核苷酸在attB2区域，此外在attB2和目的基因之间的终止密码子必须去掉
5：如果不是将PCR产物融合到C-端的tag上，那么需要加入一个终止密码子
举例：
Reverse Primer 通用模板
N-融合tag
N-tag 设计，得加上终止密码子，横线处
C-融合tag
C- tag设计，去掉终止密码子
四：BP LP反应
BP反应
这一步可以过夜反应，效率高，对反应产物进行切胶纯化处理
LP反应
Notice：
1：因为pDONR211等质粒都是含有ccdB的基因，转入普通的大肠杆菌感受态会致死，需转入到DB3.1感受态中进行扩繁。
2：1.在BP反应中一般以100fmol的PCR产物量和donor vector量为最佳，其中PCR产物量在40-100fmol之间也可以。
3：如果PCR产物大于4kb，则至少使用100fmol的attB PCR产物，但是PCR产物质量不能大于500ng。
4：可以用下面这个公式转化PCR的DNA fmol和ng之间的关系：
ng=（fmol）（N）（660fg/fmol）（1ng/106） 其中N表示DNA片段长度
example：在一个BP反应中你要用100fmol的DNA PCR产物，这个PCR产物大约长2.5kb，那这个DNA的量可以这样算：
（100fmol）（2500bp）（660fg/fmol）（1ng/106fg）=165ng
5：在进行BP反应的时候需要有attB-PCR产物或者线性化的attB表达克隆；pDONR vector；BP clonase enzyme mix。蛋白酶K可以使用实验室普通的酶。
6：对于LR和BP反应最好过夜，以保证反应完全。（在缩小比例的情况下）
Ref:
[1]LandyA.Dynamic,structural,and regulatory aspects of lamb -dasite -specific recombination[J].Annual Review of Biochemistry.1989,58:9132941.
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