荧光分析法

光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外，还会发射出比原来所吸收光的波长更长的光

特点：灵敏度高，选择性好，检测限低于紫外-可见分光光度法

分为：紫外-可见荧光、红外荧光、X射线荧光

第一节：荧光分析法的基本原理

分子荧光

分子荧光的产生

分子的电子能级与激发过程：分子的基态、激发单重态S、激发三重态T

荧光产生：

1. 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子是通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程；无辐射跃迁、只能在同一电子能级内进行
2. 内部能量转换（内转换）：当两个电子激发态之间的能量相差较少时以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程
3. 荧光发射：激发单重态最低振动能级的分子以辐射的形式发射光量子至基态的任一振动能级上
4. 外部能量转换（外转换）：溶液中激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，以热能的形式释放能量的过程，常发生在激发态最低振动能级向基态转换，外转换降低荧光强度
5. 体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程，降低荧光强度，甚至熄灭；含重原子的分子，体系间跨越最常见；溶液中存在氧分子等顺磁性分子时也容易发生体系间跨越
6. 磷光发射：分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态各个振动能级而发出光辐射，这种辐射称为磷光。波长更长，寿命长，因此三重态分子常以无辐射方式返回基态，因此室温下很少呈现磷光，一般需要冷冻或固定化

荧光的激发光谱和发射光谱

激发光谱：不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对强度（检测的荧光波长不变）

荧光光谱：表示在所发射荧光中各种波长组分的相对强度（激发波长不变）

溶液荧光光谱的特征：

1. 斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长，内转换和振动弛豫及荧光发射返回到基态各个能级
2. 荧光光谱的形状与激发波长无关：荧光光谱只有一个发射带
3. 荧光光谱与激发光谱的镜像关系：激发光谱与荧光光谱的形状相似，而且两者间存在镜像对称关系

荧光与分子结构的关系

荧光寿命和荧光效率

荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间用表示

利用分子荧光寿命差别可以进行荧光物质混合物的分析

荧光效率：执法态分子发射荧光的光子数与几台分子吸收激发光的光子数，用表示

有机化合物分子结构与荧光的关系

发射荧光条件：强的紫外可见吸收；一定的荧光效率

一般长共轭分子具有较强紫外吸收，刚性分子平面具有较高的荧光效率

本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性和共平面性增加那么就可以发射荧光或增强荧光，位阻效应导致的共平面性下降则荧光减弱，对于顺反异构体，反式空间位阻小，共平面性大，荧光强

增加π电子的取代基使荧光加强，一般为给电子取代基；减弱π电子共轭的使荧光减弱甚至熄灭，一般为吸电子取代基；还有对π电子共轭影响较小的取代基对荧光影响不大

荧光试剂

1. 荧光胺：脂肪族和芳香族伯胺
2. 邻苯二甲醛（OPA）：伯胺，脯氨酸及羟脯氨酸以外的氨基酸
3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（丹酰氯）：伯胺、仲胺、酚基
4. 测定无机离子的荧光试剂：

影响荧光强度的外部因素

1. 温度：一般随温度升高荧光强度降低
2. 溶剂：一般荧光波长随溶剂极性增强而长移，荧光强度也增强，溶剂黏度越低，荧光越弱
3. 酸度：酸度影响溶剂中分子的存在形式从而影响荧光强度
4. 荧光熄灭剂：荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象，如卤素、重金属离子、氧分子及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物。荧光熄灭原因：荧光物质的分子与熄灭剂分子碰撞损失能量；荧光物质的分子与熄灭剂作用而生成本身不发光的物质；溶解氧的存在；浓度较大发生自熄灭现象。荧光熄灭法（如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系）
5. 散射光：
   1. 瑞利散射：
   2. 拉曼散射：影响较大，必须消除，选用适当的激发波长可以消除拉曼光散射

第二节：荧光定量分析方法

溶液荧光强度与物质浓度的关系

低浓度（）时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系

荧光定量分析方法

1. 工作曲线法：与紫外-可见分光光度法不同的是，在绘制工作曲线时，常采用系列中某一对照品溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至0，将该对照品溶液的荧光强度读数调至100%或50%，然后测定其他各个对照品溶液的荧光强度
2. 比例法：工作曲线通过原点或者扣除空白溶液的荧光强度
3. 联立方程法：用于多组分混合物的荧光分析

第三节：荧光分光光度计和荧光分析技术

荧光分光光度计

• 滤光片荧光计：不能测定光谱，只能定量分析
• 滤光片-单色器荧光计：将发射滤光片用光栅代替，不能测激发光谱，但能测荧光光谱
• 荧光分光光度计：将两个滤光片都用光栅替代，可以绘制光谱

1. 荧光分光光度计主要部件：激发光源（氘灯）、激发单色器、发射单色器、样品池、监测系统
2. 仪器校正：
   1. 灵敏度校正：常用1 的硫酸奎宁对照品溶液0.05 mol/L（硫酸中）
   2. 波长校正：用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度进行校正
   3. 激发光谱和荧光光谱的校正：由于光源强度随波长而变；每个检测器对不同波长光接受程度不同；检测器的感应与波长不呈线性

其他荧光分析技术

1. 激光诱导荧光分析：激光作为光源，灵敏度更高
2. 时间分辨荧光分析：利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓时间不同进行选择性检测，应用于免疫分析
3. 同步荧光分析：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差，同时扫描发射波长和激发波长
4. 胶束增敏荧光分析：减弱碰撞，减少无辐射跃迁；降低荧光熄灭剂作用；降低荧光物质自熄灭