科研汪的日常 53 TUNEL法检测细胞凋亡

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) ：基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

科研汪常用的实验材料是冰冻组织切片，故以此为例。

a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

d.按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（现配现用），覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

e.BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

f.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按说明书比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

g.加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

h.DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

i.封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

j.拍照：切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）。

参考链接：

1.TUNEL：

https://baike.baidu.com/item/TUNEL%E6%A3%80%E6%B5%8B/5559937?fr=aladdin

2.组织Tunel：

https://www.sohu.com/a/245692640_650274