来到这里的第三周，更加爱我的室友我实验室的伙伴们，我的PI和Russell。我好像回到了当时当住院总的状态，数着天数过日子，不同的是我只希望时间能够为我多停留一秒，地球漫步才刚刚开始，我已经开始为离开而感到难过。
昨天还聊到这个，在之前的环境里，不知为何，每个人都在一种焦虑繁忙的环境里庸庸碌碌着，我们不关心其他人，也没有人关心我们，没有人在乎你过的怎样，你也无暇顾及他人，人们都在抱怨，却没有人想要改变什么。每个人都像长长列车上的一个轮子，只能被车头带着盲目的奔驰，呼啸着碾过一切，和自己。没有力气爱别人，也不爱自己。
这可能是我漫长的求学生涯中最开心的时光之一了，悔恨当初没有更努力一些，不能帮助我想帮助的人。所以呀，小刘医生，在你开心的时光里，你要打起精神来，work hard and play hard！
切入正题，让我们来聊一聊，当CRISPR遇到Single Cell时，可以碰撞出什么样的火花，而那些最聪明的脑袋，又会用它们做些什么。
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让我来尝试着用我的思路来讲一讲这个故事。
现在我们发现了一个enhancer，他可能调控了某一个promoter，我们想看看到底是调控了哪个Gene的promoter，我们会怎么做？我们可能会想办法把这个enhancer ko掉，kockdown 或者overexpression，然后测序看看哪个gene的transcript发生了改变。
那么，如果你现在有了20个enhancer呢?你时间多的话，也可以一个一个做，或者分配下去，找一伙人一个一个做。那么，如果你有了200个enhancer，你该怎么办呢？
太麻烦了，有的人就想简单粗暴的一次性解决掉（哈哈，真是符合我的审美）。他们将所有200个enhancer当作target，针对这些target设计sgRNA，然后把他们混在一起，包装成慢病毒的库，一股脑的扔到你的细胞里面去。
听起来很爽，是一种快刀斩乱麻的思路。但是然后呢？我们怎么处理那一盘我们都不知道的转染了什么的细胞？
这就到了single cell展现真正的技术的时候了。
对于single cell的常规解法是用来分析细胞的异质性，找到linage发展的规律，但是有人说，这不够fancy，single cell还可以有更强大的功能。
他们把他拿来做screen。对于我们刚刚一股脑转染的那一盘细胞，如果我们用来做Single Cell RNA-seq，我们就知道了每一个细胞的transcriptom，和control组比较，就知道了每个细胞的transcriptom发生的改变。
那如何知道我们对每个细胞施加的干预是什么呢？每个细胞里转进了几个guide RNA，每个guide是什么呢？很简单，给每一个guide加上一个barcode，然后让guide序列的插入位点接近mRNA的3‘端，根据Drop-seq的测序原理，就可以把连接着guide序列的sgRNA一起测到啦。
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就像这样。
这样你的10X测序数据里就同时拿到了你的干预条件，和干预的结果，而且，重点是你一次性拿到了200次实验的结果，而且假设sgRNA是随机分配到各个细胞中去的（虽然并没有这么理想），一次性连重复都做好了，是不是super cool呢！
提到了10X，让我们来回想一下上一篇文章的图，
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增加了一个barcode和sgRNA，有没有更简便的方法呢？
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咋CROP-seq的质粒设计中，他们将sgRNA直接放入了3‘LRT区域，使它本身成为了barcode，真的是很聪明的想法啊。
未完待续~
今天小伙伴带我去了教堂，认识了新的人，大家都在精彩的过生活，这很好。
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