【现学现卖·protocol】噬菌体的分离（3）

Where to Hunt for Phages

分离噬菌体的样本来源

选择合适的噬菌体分离方法可以增加找到所需噬菌体的可能性【现学现卖·protocol】噬菌体的分离（2），但样品的来源同样重要。

一般来说，寻找噬菌体的最佳地点是其宿主所在的环境。然而，寻找噬菌体有时可能比预期要复杂。例如，Owens等人最初打算从室内饲养的家禽中分离空肠弯曲杆菌噬菌体，但没有成功。然而，当他们尝试从自由放养的鸡中分离该噬菌体时，就成功了。这种差异的原因尚未确定。因为室内和自由放养的鸡群都可被空肠梭菌定植。显然，生长位置的细微差异会极大地影响噬菌体的分离，对各种位置和条件的样品进行采样十分重要，特别是在目标噬菌体和宿主细菌的生态学尚不清楚的情况下。

Isolation from the Environment

从环境样品中分离

噬菌体通常与宿主从同一来源分离，比如从土壤、污水或自然水体分离。

污水等水样首先要沉淀澄清，并进行过滤，以去除不需要的碎屑和细菌污染。在这之后有时需要富集步骤，特别是如果要分离针对特定细菌菌株的噬菌体。接下来，可以使用双琼脂培养试验对样品进行目标宿主测试。对于土壤样品，噬菌体可以粘附在土壤颗粒上，一般将样品孵育过夜以从土壤颗粒中游离释放噬菌体。低速离心以除去环境碎片，并过滤上清液，其他方法如上。

Common Sources for Isolation of Therapeutic Phages

分离治疗性噬菌体的常见来源

分离用于防治人类疾病的噬菌体时，最常见的来源是污水或受感染的个体（具体取决于细菌宿主类型）。

污水中含有丰富的细菌，其中很多是人类消化道中的细菌，因此也含有高浓度的潜在医疗噬菌体。比如在被医院污水污染的河水已成功分离出针对克雷伯氏菌的治疗性噬菌体。一般来说，在废物处理厂或污水源头采集污水样本（取样的位置对最终获得的噬菌体类型会产生影响），且在干旱时期收集样本有利于分离人类治疗性噬菌体。用于人类治疗的噬菌体的另一个常见来源是受感染的个体。样本可以是病患的粪便、唾液、皮肤或喉咙拭子等。

还应考虑目标宿主的生长环境。例如，鲍曼不动杆菌存在于多种环境，该物种的噬菌体可以很容易地从这些不同的环境中分离出来，但是从临床样本和医院废物中分离出来的噬菌体更具治疗功能。同样，当需要分离针对耐抗生素的细菌的噬菌体时，常使用医院污水作为其分离样本。

Isolation from Lysogens

从溶源状态分离

温和噬菌体能够将自己的序列插入宿主的基因组中或形成稳定的染色体外元件，例如质粒等。在这两种情况下，它们都可以以原噬菌体形式与宿主溶原性细菌存活数代。这些在完整的溶原性细菌中的原噬菌体，也可以作为噬菌体的来源。温和噬菌体的诱导可以自发发生，不用任何诱导剂。然而，得到的病毒的滴度太低，无法满足试验需求。可以人工诱导，其主要原理是直接破坏它们的DNA，比如将细菌暴露于紫外线或使用亚致死浓度的 DNA 损伤化学物质（如氟喹诺酮类药物或丝裂霉素 C等）。应注意优化使用方法，以便诱导溶原性细菌产生噬菌体，不要在产生噬菌体之前杀死了细菌。进行诱导后，有几种方法可以分离噬菌体。最常见的是可以使用指示菌株进行噬菌斑试验。或者，在没有发生双重感染免疫的情况下，可以在非诱导条件下将裂解物接种于溶原性细菌平板，产生更多斑块以供挑取，尽管这些斑块可能非常浑浊且难以观察。

Isolation from Diverse Environments

从各种环境中分离

从极端环境中噬菌体的分离类似于常规噬菌体分离，然而培养条件需要仿照噬菌体生存的自然条件以确保噬菌体粒子的稳定性和活性。因为环境条件决定了细菌的生长，从而决定了噬菌体的生长。除了培养条件，培养基的选择也很重要。对于嗜热菌噬菌体，可以使用结冷胶（Gelrite）凝胶代替琼脂，因为它们的熔融温度高于琼脂凝胶（Stedman等人，2009）。

目前也有为古菌开发的病毒分离方案（Fulton 等人，2009 年和 Rice 等人，2001 年）。古细菌病毒不是噬菌体（Abedon and Murray 2013），因此本文就不多写了，虽然它们的分离方案有相似之处。

主要参考文献

Van Charante, F., Holtappels, D., Blasdel, B., & Burrowes, B. H. (2021). Isolation of bacteriophages. Bacteriophages: biology, technology, therapy, 433-464.