PCR是一个很基础的试验，设计引物更是常用。引物（Primer）——也称为寡核苷酸（Oligonucleotides）或短链核苷酸（Oligos）——是用于启动DNA合成的短的单链核酸。在PCR反应中，它们与模板DNA的正链和负链结合，两者之间是目的扩增序列。
1. 上下游引物的Tm 值（Melting temperature）是什么？
上下游引物的Tm值（Melting temperature，熔解温度）是指在特定的条件下，引物与其互补序列形成双链DNA时的中点温度。在这个温度下，大约有一半的引物分子与其互补序列结合形成双链，而另一半则保持单链状态。
Tm值是设计PCR引物时的一个重要参数，因为它影响着PCR反应中引物与模板DNA的特异性结合。理想情况下，一对引物的Tm值应该相近，这样可以确保在PCR过程中引物与模板DNA的有效结合，减少非特异性扩增。
计算引物Tm值的常用公式是：Tm（°C）=2(A+T)+4(G+C)
其中，A、T、G和C分别代表引物序列中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的数量。
需要注意的是，Tm值也受到其他因素的影响，如离子强度、镁离子浓度、引物长度和GC含量等。因此，实际的Tm值可能需要通过实验优化来确定。一些在线工具和软件可以帮助预测引物的Tm值，但最终的Tm值确定通常需要通过实验来验证（在公司购买的引物，一般管子上会标明Tm）。
2. 引物的二级结构，比如二聚体（Primer Dimer）和发卡结构
由于DNA单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成的，称为发卡结构。引物二聚体其实就是一对引物或者引物自身的 3’ 端部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下从 3’ 末端延伸所形成的小分子量的双链 DNA 片段。设计引物时应尽量避免这种二级结构。
图1 引物二级结构 从左到右为发卡结构、引物自身形成的二聚体和一对引物形成的二聚体（https://www.integra-biosciences.com/belgium/en/blog/article/how-design-primers-pcr）
图2 引物二聚体在凝胶电泳图上的表现（https://geneticeducation.co.in/what-are-primer-dimers-a-beginners-guide/）
3. 关于碱基的一些基础知识
图3 碱基配对图 T和A之间两个氢键、CG之间三个氢键（https://www.integra-biosciences.com/belgium/en/blog/article/how-design-primers-pcr）
有时会设计不匹配的引物（简并引物）。不匹配是指引物上的碱基与目标序列不互补，有时必须这么设计。例如，当执行多模板PCR以从不同细菌中扩增一组相似的目标序列时，使用一对引物。
简并引物在其某些位置上具有几种不同的核苷酸。例如，在某一位点上，可以拥有A和T的等浓度的引物，而不是单一的A。用于设计简并引物的不同核苷酸组合的代码如下。
图4 简并碱基表
4. 引物长度
引物长度（Primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38 bp，因为过长会导致其延伸温度大于74°C，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
5. 引物的修饰
引物的5’端决定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3 等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
6. 引物的GC含量和Tm
GC 含量（Composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大，一般在40-60%之间。Tm通常在50-60℃之间，且正向和反向引物的熔解温度应该相差不超过5°C。
7. 引物的特异性
引物设计完成以后，应对其进行BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。各种模板的引物设计难度不一，有的模板本身条件比较困难，例如GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
8. 引物的其他设计注意点
（1）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C（三键连接更紧密），因为这样会使引物在GC富集序列区引发错误扩增。
（2）由于密码子具有简并性，第三位碱基常会发生改变。引物3'端如果终止于密码子的第三位，会影响扩增的特异性和效率。
（3）引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间。PCR扩增目的不同，引物设计的选择不同。
9. 目标条带长度
普通PCR的目标条带长度为100-3000 bp，定量PCR的产物长度一般在75-150 bp之间。
10. 目标条带（扩增产物）的其他注意
选择扩增片段时，应最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择DNA模板区域。当然有时候，这个目标条带区域是没法更换的，不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP 取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
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