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研究背景：
胶质母细胞瘤(GBM)是成人最突出、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。失巢凋亡是一种特定形式的程序性细胞死亡，在肿瘤侵袭和转移中起着关键作用。免疫疗法在癌症相关治疗中很受关注，它通过增强患者的免疫系统来对抗肿瘤。探讨肿瘤微环境的改变和免疫细胞浸润对免疫治疗和基于干细胞指数的研究至关重要。抗氧化因子的存在与肿瘤的侵袭性和耐药性相关。
研究结果：
一、胶质母细胞瘤中差异相关基因的遗传变异与表达
1、网络图显示的27个失巢凋亡相关基因的相互作用，可视化了差异基因和GBMs预后之间复杂关系（图1A）。
2、研究了27个异基因相关基因在GBM中的体细胞突变率。其中，PIK3CA的突变率最高(达8%)，其他基因的突变率相对较低（图1B）。
3、染色体定位可见失巢凋亡相关基因的拷贝数变异CNV改变（图1C）。
4、对27个失巢凋亡相关基因的研究表明，拷贝数变异CNV相关突变普遍存在（图1D）
5、研究发现27个失巢凋亡相关基因的表达在GBM的CL、MES和PN亚型中存在显著差异（图1E）。
6、探索27个anoikis相关基因对整合GEO数据集的总生存期(OS)的影响时，发现PTK2、PIK3CA、PDK4、NTRK2和ITGA5的表达与GBM患者的总生存期(OS)有统计学相关性（图1F）。
二、PTK2和ITGA5在临床肿瘤组织中的表达验证
1、肿瘤及瘤旁组织临床标本的代表性图像，利用肿瘤荧光初步鉴别肿瘤（图2A）。
2、采用免疫组化(IHC)染色检测16例胶质瘤及瘤周组织中具有代表性的PTK2和ITGA5蛋白水平（图2B）。
三、失巢凋亡模式与肿瘤微环境、干性和临床特征的相关性
1、使用NMF算法对650例患者将胶质母细胞瘤细胞分为两个簇，称为C1和C2（图3A）。
2、热图显示了在C1和C2簇中失巢凋亡相关基因的表达情况（图3B）。
3、Kaplan–Meier (KM) 分析显示，显示C1和C2簇间患者生存率的差异（图3C）。
4、分析两组间的肿瘤微环境的差异，观察到C1在几种免疫细胞（T细胞、CD8
T细胞，活化NK细胞，树突状细胞）浸润中较为丰富（图3D）。
5、干性指数分析中，C2的mRNAsi和EREG-mRNAsi更接近于1，表明C2的胶质母细胞瘤细胞与干细胞具有高度的相似性（图3E）。
6、桑基图（Sankey）图中，确定了C1和C2亚型与临床分型之间的相互关系，具有胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)岛甲基化表型(GCIMP)的GBM患者主要集中在C2（图3F）。
7、进行KEGG分析和GO分析两个基因簇的差异相关基因（图3G-H）。KEGG通路分析显示，Wnt信号通路在C1中更为活跃。
四、风险评分的构建和验证
1、基于基因表达数据的加权基因共表达网络分析(WGCNA)识别出具有高度协同变化的基因模块（图4A）。
2、获得了897个与失巢凋亡相关的差异基因，并最终确定了共表达模块。根据模块-性状关系的热图，MEblue和MEturquoise模块与临床性状的相关性最高（图4B）。
3、单变量Cox回归分析显示，存在524个基因与GBM预后相关（图4C）
4、通过LASSO算法识别GBM的预后基因集，最终找到了9个基因集（图4D-E）。
5、使用9个预测GBM患者生存和预后的失巢凋亡相关基因构建风险评分（图4F）。
6、KM分析显示，训练集和测试集的风险得分越高，生存率越低（图4G）。
7、利用时间相关的受试者工作特征(ROCs)和决策曲线分析(DCA)评估模型对预后的敏感性和特异性，并根据ROC曲线下面积(AUC)对结果进行评估（图4H），验证了应用ROC预测GBM患者的预后准确性。
五、基于GBM风险评分的诺模图
1、通过建立了一个诺模图，预测GBM在1年、2年、3年和5年的生存概率，基于高风险和低风险分数模型（图5A）。
2、诺模图在到时间依赖的ROC曲线中，预测GBM患者的生存时间（图5B）。
3、包含诺模图的训练集和测试集的ROC验证和评价（图5C），训练集和测试集的危险因素DCA（图5D）。
4、关于高危险组与低危险组肿瘤微环境浸润的差异，低危险组中存在几种免疫相关因子表现显著（图5E）。
5、关于免疫检查位点CD40LG，CD8A、JKA1、LDHB等在风险评分较低的患者中表达更为明显，而IL12A、LDHA、LDHC、TNFRSF4、YTHDF1在高危评分较高的患者中表达显著（图5F）。
6、低风险评分的GBM患者的mRNAsi和EREG-mRNAsi更接近于1，这提示低风险评分的GBM患者与高风险评分的GBM患者的分化程度较低（图5G）。
7、分析风险评分模型与GBM患者不同亚组之间的关系，Wilcoxon检验显示C1和C2之间的风险评分存在明显差异（图5H）。
六、基于TCGA数据集风险评分的验证
1、基于综合GEO队列构建了风险评分，并分析了风险评分与临床特征的相关性（图6A）。
2、KM分析显示，高风险基因的表达与较低的生存率相对应（图6B）。
3、临床特征在高、低风险评分中的比例（图6C）。
4、GBM 1年、2年、3年生存率的AUC生存率及风险评分ROC的验证（图6D）。
5、诺模模型的AUC和ROC的验证（图6E）。
七、风险评分模型的泛癌分析
1、32种肿瘤的肿瘤纯度、估计评分、免疫评分和基质评分（图7A）。
2、32种肿瘤的肿瘤微环境因子浸润细胞（图7B）。
3、32种肿瘤的干性指数差异（图7C）。
八、免疫治疗反应和药物敏感性的相关危险评分
1、log-rank检验显示，高风险评分较高的患者生存时间较短（图8A）。
2、无反应组和有限反应组(SD和PD)的患者比例相反，说明风险评分可以反映患者对免疫检查点阻断（ICB）治疗的反应（图8B）。
3、在高、低风险组与免疫表型的关系中，高风险组中沙漠现象更为明显，而低风险组中炎症更为明显（图8C）。
4、通过分析风险评分与肿瘤新抗原负担的关系，风险评分高、新抗原负担低的患者生存时间最短（图8D）。
5、风险评分显示，其中5种药物负向敏感，包括赛戊溴铵、雷帕霉素、AZD5991、萨比妥克拉、AGI-6780，而26种药物的敏感性呈正相关（图8E）。
6、探索所选药物靶向的信号通路显示，敏感性与风险评分负相关的药物靶向代谢和凋亡调节信号通路（图8F）。建立风险评分有助于探索正确有效的治疗策略。
研究总结：作者首先探索了差异基因在GBM中的差异表达和潜在的GBM亚型，接着对这些基因和亚型进行分析。揭示了失巢凋亡相关基因与临床特征、肿瘤微环境、感性、IDH突变和免疫治疗之间的潜在关系，并阐明了它们的治疗价值，并构建了基于失巢凋亡相关基因的差异表达构建了一个风险评分模型来预测患者的预后以及对免疫治疗的反应。探索致病相关的基因表达模式不仅扩展了对胶质母细胞瘤侵袭性的理解，而且有助于制定更个性化和更精确的治疗策略。
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