单细胞3' mRNA测序数据与CPM、RPKM及FPKM之间的联

最近导师push的比较紧，没有时间来做更新。（懂的都懂，谁都不想在组会上享受社会性死亡）

今天来分享一下单细胞3' mRNA测序数据与CPM、RPKM及FPKM之间的联系，首先来介绍一下CPM、RPKM以及FPKM到底是什么：

CPM

实际上和CPM经常一起出现的还有一个RPM，全称是：Reads/Counts of exon model Per Million mapped reads，当然也有文章里面简单称之为：counts per million。(Shulman and Elkon, 2019)其具体计算方法为：

实际上，翻译一下就是每100万个reads中有多少个是来源于基因A的。那么CPM到底实现了什么样的目的呢？设想一下，如果我们在单细胞测序时，由于我们技术上的偏差，使得两个细胞测序深度差异比较大，但实际上，这两个细胞本身转录出来的mRNA的量可能本身差异并不大，这个时候如果我们将两个细胞的reads数统一限制到100万，这样就能够很好的解决由技术导致的偏差，CPM就是干了这件事。

RPKM

RPKM全称是Reads Per Kilobase per Million mapped reads，其表示的含义是每千个碱基的转录在每百万个转录中读取的reads，好拗口，翻译一下，RPKM的含义就是假设我们现在拿到了100万个reads，其中一个基因每1000个外显子碱基转录出来的reads数。(Mortazavi et al., 2008)
其计算方法为：

那么RPKM完成了一个什么样的事呢？设想一下，我们在进行表达量的比较时，如果我们一个read记为一次表达，注意，这里我们进行的是全长测序，比如smart2-seq，全长测序最终我们是要将cDNA打断成小片段测序的，那这个时候，如果一个基因本身就很长，那它测得的reads数相对来说就会更多，但是不是一定它的表达量就多呢？实际上并不一定，比如一个外显子共长10000个碱基的基因转录出一个mRNA最终可能会检测到400个reads，而一个外显子共长200个碱基的基因转录处一个mRNA可能最终只会检测到1个read，但实际上它们都只转录出一个mRNA，所以我们单纯用reads总数就会出错，RPKM就很好的避免了这样的错误，“每1000个外显子碱基”很好的排除了基因长度的影响，“每100万个reads”很好的排除了测序深度的影响，可谓一举两得。

FPKM

FPKM全称Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments，其表示的含义是每千个碱基的转录在每百万个片段中读取的片段数，首先就说，FPKM和RPKM的目的是一样的，都是为了消除基因长度和测序深度的影响。那么FPKM和RPKM的区别究竟在哪儿呢？答案就在reads和fragment的区别上，RPKM适用于单端测序，FPKM适用于双端测序，reads就是指的测序得到的一个序列，而fragment指的是被双端测序的那个核苷酸片段，一般来说双端测序，两个reads能够确定一个fragment，当然也存在一个read质量不高被剔除的情况，总之，理论上是reads总数在fragment总数的1~2倍。FPKM的计算方式与RPKM是一样的，只不过用fragment替换掉了reads。

single cell RNA 3'-end sequencing

我们在单细胞3' RNA测序中，很重要的工作就是衡量不同基因的表达情况，但是我们是用CPM还是RPKM还是FPKM呢？实际上，你只能并且只会用到CPM，试想一下，3'端测序难道不是测到一个read就是相当于一个mRNA吗？这个数量和基因长度有关系吗？显然没有关系，基因再长，3'端测序终究只能对每个mRNA测到一个read，所以在这个里面根本不存在基因长度的影响，只存在测序深度的影响，而测序深度的影响是在哪里被处理的呢？这个问题可以看我前面的文章单细胞分析中的NormalizeData()与ScaleData()区别在哪儿？，相信你会找到答案。

今天又是摸鱼的一天！

参考文献：
Shulman, E.D., and Elkon, R. (2019). Cell-type-specific analysis of alternative polyadenylation using single-cell transcriptomics data. Nucleic Acids Res 47, 10027-10039.
Mortazavi, A., Williams, B.A., McCue, K., Schaeffer, L., and Wold, B. (2008). Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods 5, 621-628.