接上一篇。
Lambda扫描提供了两个重要的信息。首先，它们为每个原位荧光团提供了最佳发射光谱。这可以用来选择最合适的双色和发射滤光片组合，以最好地分离两个信号。第二，这些数据有助于揭示GFPUV和mEYFP之间是否存在FRET。我们发现，FRET普遍较低，可以忽略不计，但不同融合结构的FRET存在差异。如果荧光能量转移比率过高，那么比值分析就会变得困难，因为GFPUV的发射依赖于mEYFP的荧光。虽然这提高了pH传感器的灵敏度，但GFPUV不再独立于pH。基于这些原因，从经验上确定FRET的程度是很重要的。
4.2.4细胞表面表达受体的鉴定
YFpH中pH敏感成分与pH不敏感成分的比值应该能让我们区分表面表达的受体与细胞内酸性部分的受体。为了验证这一点，我们将YFpH融合到GluR2的N端，观察其在未处理和通透性处理后的HEK293细胞中在pH 5.5到9.0缓冲液存在下的表达模式。GFPUV(激发405nm;发射490 - 515nm)和mEYFP(激发488nm;发射517 - 560nm)在适当的时间间隔交替进行，再次注意尽可能降低激发激光功率，尽量减少光漂白。构建mEYFP: GFPUV的比值图像。
比值分析必须非常小心，以尽量减少噪声的引入。方案4.2中描述的原则在FRET分析中同样重要。首先将阈值应用于比值对中的每幅图像，以将背景荧光从所需信号中分离出来。然后将识别为背景的图像排除在进一步的分析之外。在阈值化和比率化之前，中值滤光片可以应用于图像，以在必要时提高信噪比。然后将这些必须为每个图像集确定的参数应用于序列中的所有图像，并生成mEYFP/GFPUV的比值图像。
通过选择一个通常不表达研究受体的细胞系，就可以通过简单地使用合适的激动剂和测量预期的反应来测试功能受体的存在。在这种情况下，我们使用全细胞膜片钳方法来测量短暂应用谷氨酸后的向内电流。在确定细胞在细胞表面表达功能受体后，下一步是将表面表达模式与mEYFP: GFPUV比值相关联。4.3具体描述了如何使用抗GluR2抗体标记细胞表面YFpH-GluR2;该协议可用于GPCRs。为了维持pH梯度，必须使用活细胞。
随后，可以使用在原始mEYFP和GFPUV图像以及比值图像上放置相同位置的ROI进行测量。静态ROI测量随着时间的推移观察来自细胞膜或细胞质的受体。另一种方法是根据像素的比值来识别像素，并将其放入相应的群中。因为每个群体中的像素数量是已知的，所以这对于测量随时间推移的表面或细胞内受体的总体比例是有用的。
这种分析依赖于准确地确定表面受体的比值。从未经透过性处理的表达YFpH-GluR2的HEK293细胞中收集比值图像，首先pH为 7.4，然后在切换到pH 5.5。短暂降低细胞外pH对细胞内pH无影响，但有选择性地在细胞表面猝灭mEYFP。GFPUV荧光不变。在每个pH值下采样的比值数据的频率分布图显示比值的总体分布发生了微小但可重复的变化：比值值低的像素数量增加，而比值值高的像素数量减少。这种差异非常小，因此很难从原始直方图中看到，因为低比值像素的数量远远超过高比值像素的数量。因此，可以构造累积概率曲线。这些显示了分布上的显著差异。对于所示的示例，当像素比值大于1.3时，差异变得明显。这种校准技术可以很好地估计出最佳分离两个受体群体的比率。这个过程可以使用弱碱重复出来，如会增加细胞内的pH值的氯化铵。在这种情况下，溶液中的游离氨穿过细胞膜，与游离的质子反应，提高细胞内隔间的pH值。在冲洗时，在缓慢恢复之前，细胞内酸化会发生反弹。这种方法不提供精确的细胞内pH值的变化，但它在细胞间隔内产生一个相对选择性的受体pH值的变化。
该技术的一个应用是实时监测细胞表面受体的内吞。如应用胰岛素或谷氨酸受体激动剂等治疗方法已被证明可导致HEK293细胞中含有GluR2的AMPA受体的内吞。
比值成像的优点可以通过与钙成像技术进行比较来说明。Fura-2等比值染料允许对钙浓度进行绝对测量，因为它们发出与钙浓度无关的荧光信号和钙依赖信号。然而，单波长的钙染料只能检测到钙在未知基线水平上的变化。校准是困难的，因为染料的浓度是未知的。比值pH传感器可以很容易地校准，因为传感器的表达水平是已知的。
除了用于监测受体的转运外，比值pH传感器还可用于标记诸如synaptobrevin或synaptotagmin等泡状蛋白。除了可以直接观察释放池中释放的变送器，比值pH传感器还可以提供未积极参与释放过程的储备池中囊泡的信息。因此，可以通过mEYFP:
GFPUV比值发射信号来估计突触前末端突触的释放特征。
4.3 troubleshooting
•许多受体需要信号肽来帮助受体穿过内质网到达质膜。肽在转运过程中被裂解，成熟肽留在膜中。在这种情况下，荧光蛋白传感器必须插入到信号肽和成熟受体序列之间。对于其他受体，如CB1受体，使用蛋白传感器增加N端长度可能会影响表达。高效的表面表达需要引入从人类生长激素中提取的人工序列。
•比值图像会引入显著水平的噪声，尤其是在GFPUV信号的荧光强度非常弱的情况下。照明强度应该调整，以产生良好的对比度，明亮的图像，但同时要记住，更高的强度促进光漂白。如果蛋白表达水平较低，则最好通过增加针孔的大小来降低原始图像的空间分辨率，将共焦图像格式减少到256×256，或者对于基于相机的系统，通过像素融合来降低图像的空间分辨率。
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