**杂志： **COMPUTERS IN BIOLOGY AND MEDICINE
**影响因子： **7
研究概述：
背景：扩张型心肌病(DCM)是心衰的常见原因。然而，细胞衰老在DCM中的作用尚未完全阐明。本文旨在研究DCM的衰老，鉴定衰老相关的特征基因，并探索潜在的治疗DCM的小分子化合物。
方法：作者分别从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库和CellAge数据库中获取DCM相关数据集和衰老相关基因。通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)、最小绝对收缩和选择算子(LASSO)和随机森林等方法鉴定特征基因。在小鼠DCM模型中验证了特征基因的表达。应用CIBERSORT算法对DCM的免疫特性进行了分析。最后，通过CMap分析预测了几种治疗性化合物，并通过分子对接和分子动力学模拟研究了绿原酸(CGA)的潜在作用机制。
结果：通过综合转录组分析最终鉴定出3个与DCM和衰老相关的特征基因(MME、GNMT和PLA2G2A)，并在阿霉素诱导的小鼠DCM中进行了实验验证。建立的诊断模型对DCM具有较好的诊断效果。免疫细胞浸润分析提示DCM炎症失调，特征基因与侵袭性免疫细胞显著相关。最后，基于DCM的特异性基因表达谱，通过CMap分析预测了几种潜在的治疗化合物。此外，分子对接和分子动力学模拟表明，CGA可以结合到MME蛋白的活性口袋上。
研究流程图：
研究结果：
鉴定DCM中与衰老相关的差异基因
作者首先对我们首先对训练数据集GSE57338进行主成分分析，结果显示对照组和DCM组之间存在明显的特征(图2A)。共鉴定出314个差异基因（deg），其中上调154个，下调160个(图2B)。采用分层聚类算法对每个比较组的deg进行分析，并以热图的形式进行可视化(图2C)。然后进行GO和KEGG富集分析，以探索与DEGs相关的生物学功能和信号通路（图2D-F）。KEGG富集结果表明，DEGs在“PI3K-Akt信号通路”、“JAK-STAT信号通路”、“TNF信号通路”等通路中显著富集(图2G)。作者将收集的866个衰老相关基因与deg相交后，鉴定出25个与衰老相关的差异基因（DESRGs）。Spearman相关分析显示DESRGs之间存在显著的相互作用(图2I)。作者对以上25个基因进行了再次的GO和KEGG分析（图2J&K），发现与已发表的相关文献结果一致——衰老心肌可诱导并伴随二倍体细胞有丝分裂停止、炎症浸润、心肌纤维化和细胞死亡。
鉴定与DCM相关的基因模块
WGCNA用于鉴定与DCM显著相关的基因模块（图3A&B）。将特征基因高度相关的模块合并后，最终鉴定出16个基因模块(图3C和D)，并对模块-性状关系进行评估和可视化。红色模块和棕色模块与DCM的正相关性最高；相反，黑色模块和粉红色模块与DCM负相关性最大(图3E)。此外，以上四个模块的模组隶属度(MM)与基因显著性(GS)的相关性均显著(图3F-I)。故，作者从上述模块中选出2207个基因作为DCM相关的关键基因进行后续分析。
机器学习法筛选与DCM相关的核心基因
作者使用LASSO回归（图4A-B）和RF(图4E)两种机器学习算法从25个DESRGs中鉴定出与DCM和衰老相关的特征基因。ROC曲线显示该模型具有理想的诊断性能(图4C)。最后，LASSO回归鉴定出13个枢纽基因，包括BCL6、PLA2G2A、MME、STAT3、TEAD4、GNMT、MTHFD2、JAK2、CRISPLD2、BCL3、NQO1、HOPX和SERPINE1。对于RF算法，将诊断误差可视化，并根据变量重要性对候选基因进行降序排序(图4D和E)。MeanDecreaseGini >4的基因被确定为重要基因，包括BCL6、STAT3、TEAD4、MME、NAMPT、PLA2G2A、GNMT、SAMHD1和MTHFD2。将LASSO和RF算法以及WGCNA分析后的基因取交集（图4F），得到三个特征基因MME、PLA2G2A、GNMT（图4G）。为了进一步揭示三个特征基因(PLA2G2A、MME和GNMT)的生物学功能和信号通路，作者使用单基因GSEA方法对每个基因进行GO和KEGG富集分析，发现这些特征基因可能在细胞衰老、细胞存活、免疫浸润和代谢的调控中发挥重要作用（见文献文章Fig.5）。
构建DCM的诊断列线图
作者利用“rms”包构建了基于特征基因的DCM诊断谱图。在nomogram中，每个基因对应一个评分，3个基因的总分被用来预测DCM的风险(图5A)。校正曲线显示，nomogram预测概率与理想模型的预测概率基本一致(图5B)，决策曲线分析表明，根据nomogram进行决策是有益的(图5C)。训练队列表达分析显示，DCM中MME表达显著上调，PLA2G2A和GNMT表达明显下调(图5D);三个枢纽基因均表现出良好的诊断性能:PLA2G2A、MME和GNMT的ROC曲线下面积(AUC)值分别为0.88、0.897和0.857(图5E-G)；基于三个枢纽基因的nomogram诊断效果较好，AUC值为0.96(图5H)。此外在文章图7中作者还在其他三个数据集中验证了三个特征基因的表达和诊断性能，评估结果表示基于三个枢纽基因的nomogram诊断效果较好，AUC值均在0.9以上。不仅如此，作者还构建了DOX诱导的小鼠DCM模型，并进行了qRT-PCR分析，与生物信息学分析结果一致，小鼠DCM中MME的表达显著上调，而GNMT和PLA2G2A明显下调(图6G-I)。
免疫浸润分析
考虑到衰老可以诱导衰老相关的分泌表型（SASP）和炎症，作者对上述样本进行了免疫浸润分析，发现与对照组比较，DCM组肥大细胞静止、浆细胞和T细胞CD8比例增高；然而，巨噬细胞M2、单核细胞、T细胞CD4记忆静息和T细胞调节性(Tregs)的比例较低(图7B)。相关分析显示，T细胞调节性(Tregs)、B细胞和T细胞CD4记忆静息呈显著正相关;浆细胞、巨噬细胞M2和单核细胞呈显著负相关(图7C)。我们进一步探索了免疫细胞与三个枢纽基因之间的相关性，热图(图7D)显示巨噬细胞M2和T细胞CD8在心肌组织中占很大比例，并且都与三个特征基因显著相关(图7E-J)，提示这两种免疫细胞可能在DCM的进展中发挥更重要的作用。
鉴定治疗DCM的候选小分子药物
为了进一步探索可能逆转DCM基因表达模式并发挥治疗作用的潜在小分子化合物，作者利用 CMap数据库筛选评分前10的化合物，分别是tyrphostin-AG-1295、QX222、雌激素、ABT-751、灰黄霉素、ON-01910、拉帕替尼、SJ-172550、地塞米松和U-0124。此外，有研究报道小分子化合物CGA具有抗衰老和保护心血管作用。而枢纽基因其一MME可以介导多种细胞的衰老。在本文中作者还探讨了CGA与MME之间的关系， 分析对接分析表明CGA与MME之间具有很强的结合亲和力（图8A）。随后，作者进行了分子对接模拟来研究MME/CGA结合相互作用的结构稳定性和构象灵活性。如图8B所示，在模拟过程中，该蛋白的RMSD没有明显波动，暗示蛋白结构没有坍塌，说明小分子CGA可以连续结合到蛋白MME的口袋上。值得注意的是，在72 ns时，通过构象调整获得了更优化的结合姿态:小分子的整体结合位置保持不变，但苯环基团向内移动，使得结合更加稳定(图8C)。该蛋白的RMSF几乎都在2 Å以内，说明该蛋白的主体结构是刚性的(图9D)。作者还监测了配体和蛋白质之间氢键的数量。如图9E所示，在模拟过程中，MME/CGA复合物中形成了1 ~ 9个氢键，大部分为4个，说明氢键对配体与蛋白质的稳定结合起到了重要的作用。此外，MM/GBSA (kcal/mol)预测的结合自由能和能量组分。MME/ CGA的结合自由能为-27.10±3.56 kcal/mol，表明其具有较强的配体-蛋白结合稳定性。
研究总结：
该研究通过综合转录组分析，鉴定出3个衰老相关特征基因(MME、PLA2G2A、GNMT)，并在小鼠DCM模型中验证其表达。在此基础上，构建了一种具有较理想诊断性能的诺瓦图。此外，免疫细胞浸润分析提示DCM存在炎症如M1/M2巨噬细胞异常极化，其与三个特征基因表达也存在相关性。最后，作者通过CMap数据库筛选了几种潜在的小分子治疗药物;分子对接分析和MD模拟表明，CGA可能通过稳定结合MME蛋白的活性口袋发挥MME抑制剂的作用。总的来说，这是第一个提出基于衰老的DCM诊断图的报告，并讨论了CGA治疗DCM和心力衰竭的潜在新机制。
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