Long Y, Zhang Y, Gong Y, et al. Diagnosis of sepsis with cell-free DNA by next-generation sequencing technology in ICU patients[J]. Archives of medical research, 2016, 47(5): 365-371.
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Archives of medical research
1. 摘要
背景：菌血症需要诊断病原，并根据不同的病原选择抗生素，本研究通过mNGS检测测血浆DNA来诊断菌血症
方法：78份ICU血浆（满足SIRS标准2条以上）同时做血培养和mNGS，并用PCR/Sanger测序验证。10份健康志愿者的血浆用来定义及校准mNGS阈值。
结果：24个病人mNGS阳性，但仅10个病人血培养阳性。7个血培养和mNGS同时阳性，其中2个样本中mNGS检测到2中细菌，仅1份样本中血培养检测到2种细菌。1血培养检测到11种细菌或真假，mNGS检测到17种细菌或真假。有趣的是NGS还诊断出14个标本中有病毒序列。对于ICU患者，总体诊断敏感性从血培养的12.82％（10/78）显著提高到NGS单独的30.77％（24/78）。
阳性率不代表真阳性率，mNGS阳性、培养阴性的这部分病人值得进一步研究（其中定植的有多少，由于污染导致的有多少）
以血培养作为金标准：mNGS 灵敏度为 72.7%，特异度为89.6%, 阳性预测值为53.3%, 阴性预测值为95.2%, 约登指数为62.3%。
结论：mNGS可用于检测临床血液样本中的细菌。
2. mNGS检测流程
1. 收集样本并测序
2. 预处理（筛除短序列<35pb和低复杂度序列）
3. 移除BWA比对到人基因组GRCh37的序列
4. 剩余的序列比对从NCBI下载的细菌、真菌、病毒数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/all.fna.tar.gz, on 8/29/2014 and ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Virus/all.gbk.tar.gz, on 1/25/2015).），包括1491种细菌、 2,804个病毒基因组，54个有临床意义的真菌。
需要3天时间出具检测结果报告。
mNGS检测流程
结果解析
严格比对：BWA比对结果中比对质量 > 10；所有数据都标准化到 20 million clean sequence reads。
（a）所有检测出的微生物按照覆盖度进行排序，仅分析排名前10的物质
（b）严格比对序列数大于3且超过正常标本的上限（10份志愿者标本，Q3+3IQR），覆盖度必须超过正常值上限
（c）根据致病性和患者临床症状，临床医师确定致病菌并开始经验治疗
3. 其他检测微生物流程
3.1 血培养
培养系统： BD BACTECFX40(Becton Dickinson)
自动鉴定菌种系统：Vitek MS system (BioMerieux)
3.2 Sanger验证
mNGS与血培养阳性的标本，使用特异的PCR扩增后，再用ABI 3730 Genetic Analyzer进行Sanger测序验证。测出的序列再用BLAST和NT数据进行比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM5blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC5blasthome）
4. 结果
4.1 数据量
88个血浆样本（78+10），使用BGISEQ-100共产生1, 823, 490, 377条原始序列，移除短序列及低复杂度序列后剩余1,769, 631, 753条。平均每个样本 20, 721, 481条原始序列和20, 109, 451条质控清理后的序列，平均95.59%比对到了人基因组上。其中未比对到人基因组上的序列中，10个健康志愿者中，0.201%, 0.011%及0.093%分布比对到细菌、病毒和真菌基因组中；ICU病人中为0.072, 0.037, 0.076%。[细菌、真菌的比对比例下降，病毒的比对比例增加]
4.2 正常样本中的数据分析
用次数据校准参考阴性值，覆盖度和严格比对序列数用来确定是否为致病菌。比对到细菌基因组的序列是最多的特备是Propionibacterium acnes（疮疱丙酸杆菌，最常见的皮肤定植菌）, 其覆盖度为 0-5.132%。
4.3 临床标本的检测结果
补充表1列出了阳性病人的详细结果（血培养和mNG）
补充表1 27个阳性病人结果
补充表2 统计检测出的病原和检测阳性的病人
因为一个病人可检测出多个病原，因此分开统计病原和病人。
1. 病人14P1005640同时由mNGS和血培养诊断为Enterococcus faecium（屎肠球菌）及Acinetobacter baumannii（鲍曼不动杆菌）混合感染。
2. 病人RTI2020-1的mNGS结果为Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌） 和Enterococcus faecium（屎肠球菌），而血培养仅为Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌）阳性。
3. 病人14P1005636-2仅血培养出Candida albicans（白色念珠菌），mNGS为阴性。
4. mNGS在14个病人中检测出15次病毒，病人RTI2054-1为cytomegalovirus (CMV) 和herpes simplex virus-1 (HSV1)同时阳性。
4.4 血培养和mNGS的一致性
两种方法检测的病原比较
血培养在10个病人样本中检测出10次细菌和1次真菌，mNGS在15个病人中检测到17次细菌。总共在18个病人中检测到19次细菌和1次真菌。
以血培养作为金标准mNGS的检测价值如下：灵敏度为 72.7%，特异度为89.6%, 阳性预测值为53.3%, 阴性预测值为95.2%, 约登指数为62.3%。使用McNemar’s卡方即配对卡方检验发现两种检测方法无差异。一致性检验表面具有一定的一致性（k 50.54, p < 0.001）。
mNGS与血培养四格表
下图表明两种方法以OR方式组合后，阳性率由单独血培养的12.82% (10/78)提高到了23.08% (18/78)。【不算病毒在内，包括病毒则提高到30.77%(24/78)】
再次强调阳性率不代表真阳性率，mNGS阳性、培养阴性的这部分病人值得进一步研究（其中定植的有多少，由于污染导致的有多少）
阳性率的改善
mNGS与培养结果（以病原为单位）总结
在14个病人标本中，mNGS检测到的15次病毒包括CMV, EBV, HSV-1 和 human parvovirus B19（人细小病毒B19）。
Sanger验证结果
血培养阳性的11个病原中9个Sanger阳性（一致率81.82%）。32个mNGS检测阳性的病原中Sanger全部阳性（一致率100%）。
Sanger验证结果
培养的缺点：不能检测病毒、不能检测苛养菌（bacteria that are difficult to culture）
mNGS的优点：诊断病毒感染，不需要预先推断是哪一种感染。
mNGS分为两个流程，一是DNA流程，只能检测DNA病毒和细菌真菌；二是RNA流程，只能检测RNA病毒。一次检测费用大约4000元左右（一个流程￥4000，因此还需要跑DNA流程后还需要排除一些RNA病毒）
5. 讨论
1. >95%的序列是比对到人基因组，而<1%的基因组比对到病原基因组上，大约4%的序列无法比对上人或病原基因组。对这4%的序列进一步分析显示超过一半的序列是比对到人基因组上的，大约10%比对到灵长类动物基因组（与人类基因组非常相似），其余序列比对到鼠（Mus）、猪（Sus）、果蝇（Drosophila）基因组中。奇怪的是不管样本是来自健康志愿者还是感染者，都仅有1%的序列可以比对到病原基因组中。比对到灵长类动物序列的来源值得深入研究。改善mNGS的诊断能力需要进一步开发移除宿主DNA、提高比对到病原基因组序列比例的技术。
2. 微量的DNA污染在实验室中广泛存在，Lust et al.报道试剂及离心管中普遍存在微量污染。Susannah et al.的研究表明DNA污染普遍存在于DNA提取试剂和其他试剂中。mNGS的步骤较多，实验室环境和试剂可能会导致假阳性的存在。该研究发现在健康志愿者的10例标本中也可以检测出微生物的序列，如 Propionibacterium acnes（疮疱丙酸杆菌，最常见的皮肤定植菌），这表明规范的实验室操作流程和校准步骤是非常重要的。
3. 血培养和mNGS不一致的问题值得深入研究，8个标本血培养阴性而mNGS阳性，可能是由于经验性使用抗生素导致在收集标本之前细菌死亡。病人14P1006507-1和14P1005641-1分别被血培养诊断为Acinetobacter baumannii（鲍曼不动杆菌）和Enterococcus faecalis（屎肠球菌）感染，但mNGS和Sanger测序均为阴性，鲍曼不动杆菌和屎肠球菌是常见的医院感染病原菌，由于标本采集污染造成的假阳性并不能被排除。病人14P1005636-2的血培养和Sanger测序均为 Candida albicans（白色念珠菌）阳性，但mNGS阴性，可能是PCR/Sanger测序灵敏度比mNGS更高【还可能是真菌壁厚，DNA不容易提取】。病人RTI2020-1的mNGS结果为Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌）和Enterococcus faecium（屎肠球菌）阳性，但血培养仅Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌）阳性，这可能是血培养中主要菌种生长而抑制其他菌种导致的。
4. 在阳性的样本中，14个病人被mNGS诊断为有病毒感染，病人RTI2054-1同时有CMV和HSV1阳性；ELISA 和荧光定量是临床中检测病毒最常用的方法，然而是否对病毒进行检测常依赖临床医师的经验和其对病人的判断。同时检测病毒和细菌病原体是mNGS的优势之一。已经有报道利用mNGS检测特定病毒感染，然而并不包括RNA病毒，如何同时做到检测RNA和DNA病原需要进一步研究。【如果是新冠肺炎，只跑DNA流程就发现不了】
5. mNGS检测需要2-3天，这个时间对于临床诊断来说还是太长，随着自动化，方案优化及同步处理的技术发展，周转时间可进一步缩短。mNGS的价格也相对较贵，这限制了其常规使用，不过随着测序及试剂价格降低今后可能会下降。
In the future we will focus on the diagnostic use of cell-free DNA/RNA for the identification of pathogens and improve our detection methods in a larger sample size in a hospital and ICU setting.
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