Emergence of the third-generation cephalosporin-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae due to the acquisition of a self-transferable blaDHA-1-carrying plasmid by an ST23 strain
前情提要：
接合质粒和整合性接合元件(Integrative and conjugative element, ICE)，是细菌致病性和耐药性传播的重要载体。接合性质粒和ICE的接合转移区通常由四个模块组成：转移起点（oriT）区，松弛酶 (relaxase)，IV型伴侣蛋白 (type IV coupling proteins, T4CP)和细菌IV型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)，该研究团队开发了生物信息学软件oriTfinder，用于快速识别质粒和ICE序列中的oriT、松弛酶、T4CP和T4SS等接合转移功能模块，相关研究请查看“Nucleic Acids Research| oriTfinder: 细菌耐药质粒接合转移研究工具”。
前言：
肺炎克雷伯菌是一种重要的人类病原体，近年来多药耐药性（MDR）水平急剧增加，特别是对碳青霉烯类和第三代头孢菌素的耐药性，已成为重要的全球性问题。常见的耐药型是ST11、ST258。值得注意的是，越来越多的研究报道了肺炎克雷伯菌的超毒力变体（hypervirulent variants of K. pneumoniae、hvKP），可在健康和非卧床个体中引起严重感染，例如肝脓肿，眼内炎，脑膜炎，骨髓炎，坏死性筋膜炎。hvKP通常具有高黏液和高毒力表型，并且主要属于K1荚膜型的ST23和K2血清型的ST86和ST375。与经典的肺炎克雷伯菌（classic K. pneumoniae，cKP）相反，除了氨苄青霉素外，hvKP通常对用于临床治疗的抗微生物剂表现出较高的敏感性。然而，在过去十年中，即使在充分记录的K1和K2血清型hvKP菌株中，也越来越多地出现具有高度耐药性的hvKP。研究发现，ST11碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌菌株已获得毒力质粒，形成了ST11碳青霉烯耐药超毒力变体（hv-MDR-KP）。在cKP中，发现获得性抗性基因主要存在于质粒上，例如，碳青霉烯类抗性基因blaKPC-2和粘菌素抗性mcr-1基因。类似地，质粒也是多药耐药性hvKP（MDR-hvKP）中出现耐药基因的主要载体。blaCTX-M-3基因在法国分离的ST86和K2 hvKP的IncL/M质粒上发现。在中国发现了K1血清型的碳青霉烯抗性ST23 hvKP，其blaKPC-2基因位于不可转移的质粒上。典型的产生碳青霉烯酶的cKP（ST258）和K2 hvKP（ST65）之间的接合显示，携带blaKPC-2或blaKPC-3基因的质粒可以转移到hvKP中并保留在hvKP中。Siu等报道了一例由hvKP引起的复发性肝脓肿，并在体外成功模拟了blaCMY-2基因从大肠杆菌转移至K2 hvKP。然而，到目前为止，还没有关于hvKP携带的抗性质粒可转移至其他hvKP菌株的报道。在本研究中，以第三代头孢菌素耐药肺炎克雷伯菌为研究模型，开展耐药质粒接合转移的实验验证工作。近年来，关于多重耐药高毒力肺炎克雷伯菌的报道呈现增多的趋势，但耐药质粒在高毒力肺炎克雷伯菌中的接合转移还未见报道。
主要研究内容：
该文章研究人员和上海交通大学医学院附属瑞金医院重症学科瞿洪平教授研究组对分离自患者痰液样本的高耐药高毒力表型的肺炎克雷伯菌RJA166开展了合作研究。RJA166为ST23分型和K1荚膜表型，具有高黏液和高毒力表型 (拉丝实验阳性；BALB/c小鼠半数致死剂量为2.3×102 CFU)；且对第三代头孢菌素具有耐药性 (头孢他啶MIC>64μg/ml)；通过比较头孢他啶和亚胺培南对于RJA166感染小鼠的干预效果，确定了RJA166在小鼠体内同样具有对第三代头孢菌素的耐药性（Fig.1）。
Figure 1. Effect of ceftazidime and imipenem on K. pneumoniae RJA166 infection in murine model.
RJA166有一个 230 kb的IncH耐药质粒pRJA166a（Fig.2），携带第三代头孢菌素抗性基因blaDHA-1。虽然在以大肠杆菌 HB101或J53作为pRJA166a接合转移实验的受体菌时，无法观察到接合子的出现；但根据oriTfinder软件的预测，pRJA166a是一个接合转移质粒，具有oriT、松弛酶、T4CP和T4SS等完整的转移功能区。研究人员进而尝试了其它受体菌，发现了pRJA166a具有从RJA166向肺炎克雷伯菌其他高毒株 (ST23型和ST374型) 和肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株 (ST11 型) 发生接合转移的能力，转移频率约为 10-6/donor cell；而且，pRJA166a可在多种受体菌中稳定遗传，对受体菌毒力无显著影响。
Figure 2. The genetic context of the blaDHA-1 gene in the resistance plasmid pRJA166a of K. pneumoniae RJA166.
通过比对发现，pRJA166a的骨架与先前报道的IncHI5组质粒高度同源，即Raoultella ornithinolytica YNKP001的pYNKP001 dfrA和K.michiganensis E718的pKOX_R1。值得注意的是，除了与pKOX_R1和pYNKP001 dfrA同源的区域外，pRJA166a还具有与抗生素抗性基因，整合子，转座子和基于插入序列的移动元件相关的26kb辅助区域（RJA_27650..RJA_27825）（Fig.3）。在这个镶嵌状的三模块区域中，blaDHA-1基因存在于辅助抗性区域的模块II上，该区域是该26kb区域的相对大部分。blaDHA-1基因通常由属于IncH和IncR不相容性组的质粒携带，其上下游环境比较保守：Sul1QaceΔ1-ampR-blaDHA-1-pspABCDF-qnrB4。这种结构通常与I类整合子和ISCR1相关；然而，未发现完整的整合子，pRJA166a中不存在5'-CS或整合酶基因，而整合酶基因在携带blaDHA-1的质粒中高度保守。模块II位于pRJA166a中的ISCR1上游和IncF质粒pKP048中，但在pYNKP001-dfrA中位于ISCR1的下游。另外，包围模块II-III的IS26序列相反，但是未观察到靶位点重复。由于它们的方向相反，提示IS26以及夹在它们之间的模块II-III形成复合转座子，介导基因的水平转移。因此，考虑到pRJA166a辅助区域的高度镶嵌状结构，获得的多药耐药基因可能是历史上基因组发生插入、缺失和重组事件的遗物。
Figure 3. Organizational map of the 26-kb accessory resistance region (RJA_27650…RJA_27825) on pRJA166a.
文章主要结论：
该研究调查了第三代头孢菌素抗性肺炎克雷伯菌超强毒（ST23 MDR- hvKP）临床菌株（RJA166）的遗传背景和微生物学特征。属于K1血清型的ST23 hvKP菌株携带的具有blaDHA-1基因的天然质粒可转移至hvKP和cKP，可能是肺炎克雷伯菌和其他病原体之间耐药性快速传播的原因。
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