空间转录组介绍

疫情当前，我们延缓了返校，延缓了复工，但丝毫没有阻挡我们追求上进的心。居家隔离的日子，各个公司争相推出满满的线上培训课表，虽然进不了实验室，但是大脑被这知识盛筵喂得饱饱的。而最受欢迎的，莫过于空间转录组的培训，动辄就上千人，而且大家的提问也很热烈，充分显示了科研工作者对这项刚推出不久的新技术的浓厚兴趣。今天，就带大家全面了解一下这项新技术——Visium 空间转录组测序。

为什么要做空间转录组呢？我们从下图案例中就可直观感受到。如果使用单细胞测序，A和B两个样本可能分析出来的细胞亚群是一样的，但事实上，A病人的预后效果就比B病人好，因为他的淋巴细胞使均匀地浸润在组织中，而B病人的淋巴细胞被肿瘤阻挡在外面。空间转录组测序就能很好地解释这一预后差异。

一、实验流程

单细胞转录组测序相信大家都不陌生了，它是将组织里的细胞打散制备成单细胞悬液，很多老师就遗憾，这样就不能知道细胞的空间位置信息了。单细胞功能不仅仅是由细胞本身哪些基因是否活跃来定义的，组织在组织样本中的位置也同样重要。而现在，空间转录组技术就解决了这一技术难题，只需提供H&E染色的切片，就可得到切片相应位置的基因表达信息，将传统组织学技术的优势与RNA测序的高通量特点相结合，在组织中呈现基因表达空间分辨率水平的可视化信息。看一下实验流程，就可知道这一目标是怎样实现的了。

将新鲜冷冻的组织切片，置于文库制备载玻片上，经过固定，染色和透化后，释放出mRNA，mRNA与空间条形码捕获探针相结合，从而捕获基因表达信息。然后将捕获的mRNA合成cDNA并制备测序文库。测序后，对数据进行可视化分析。从样品到文库制备的工作流程可在1天内完成。

二、技术原理

空间基因表达解决方案技术核心在于载玻片部分，用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域（6.5x6.5mm，玻片上四个方框），每个捕获区域含有5000个被条形码标记的点（barcoded spots，下图中颜色不同的彩色圆点），直径为55μm，（两点之间中心的距离为100μm），每个点都有一个独特的条形码序列（下图毛毛虫第二段绿色的Spatial Barcode），每个点中的每条毛毛虫上的UMI都不同，用以区别同一细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，实现绝对定量。当RNA从组织切片的细胞中释放出来后，迁移到每个点的RNA会被标记上相应的条形码序列，然后进行文库构建并进行测序。接下来，根据数据的条形码信息对数据进行分配，以确定哪些数据来自哪个位置。最终实现空间基因表达的可视化。我们来放大载玻片看一下。

这里要特别提一下样本制备，不能直接用液氮速冻的组织，急速降温会导致细胞损伤，10X官方建议使用OTC包埋的异戊烷速冻组织。多少老师单细胞实验卡在悬液制备这一步了，多次消化还是得不到符合上机要求的单细胞悬液，而即使勉强上机，也面临着细胞状态不好，捕获到的细胞数目过少，甚至多细胞的风险。但空间转录组就简单多了，冷冻好组织（最好在有经验的公司指导下操作），后面的组织透化摸索、染色、固定、透化、建库、测序、分析等等步骤，统统丢给公司做吧，节省下来的时间来读读文献，思考一下怎么写基金，申请实验经费。

三、适用范围

该方案广泛适用于癌症、肿瘤免疫学、神经科学、发育生物学等领域的研究。

目前已测试过如下组织类型*：

· 人：心脏、肾脏、卵巢、乳房、淋巴结

· 小鼠：脂肪、脑、小肠、胃、肝脏、大脑、四头肌、肺、睾丸、甲状腺、眼睛、舌头、大肠、脾脏、乳腺

· 大鼠：脑、肾脏、心脏

*此表仅列出了目前为止经过测试的样本类型，更多兼容样本类型更新请参考10x Genomics官方网站

四、结果展示

Visium空间基因表达解决方案数据展示：

A．对小鼠大脑切片进行H＆E染色，成像，然后通过Visium空间基因表达解决方案工作流程进行处理；B. 展示了含有UMI计数的数据与组织空间位置的图像叠加；C. 总基因计数；D. 基于总差异表达基因的空间naÏve聚类（spatially naÏve clustering）。最右边显示了相比于其他细胞簇，在细胞簇4（绿色）中高表达的基因。

A. H＆E染色小鼠冠状脑组织切片；基因Selenow（B）和基因Tmsb4x（C）的空间mRNA表达为大脑中已知的表达模式，主要在海马体中表达。图中结果显示了这两个基因在海马体中有显著表达，并且与已知的表达模式一致（注意：点大小不是按比例缩放）。

10X Genomics提供给科研工作者免费的空间转录组测序分析软件：Space Ranger 和Loupe Browser。Space Ranger实现自动处理数据和图像；根据基因表达分析亚群；数据质控。Loupe Browser和单细胞的loupe一样，实现空间基因表达数据的可视化，用户交互体验满足个性化分析需求。

五、案例分析

下图是10X 官方列出的已发表的空间转录组的文章。

   我们来看一下Cell上一篇关于人类心脏发育的空间基因表达和细胞图谱的文章：A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart。

文章利用单细胞测序技术以及空间转录组测序技术绘制了人类心脏发育的基因表达，构建了3D器官基因表达图谱。研究亮点：描述了人类心脏基因的时空表达模式；分析了人类胚胎心脏细胞类型的分布和空间组织；深入分析了不同细胞类型在心脏发育中的作用；创建了可供使用的人类胚胎心脏网络资源。

空间转录组：本研究取了三个时间段，4.5-5；6.5-7；9周的人类心脏共19张切片做了空间转录组分析，共得到10个亚群，并将这些亚群映射回组织切片对应位置，发现三个时期中都有clusters 0, 1, 2, 3, and 4 (myocardial regions)；与其他两个时期相比，4.5–5个PCW组织中的OFT和larger vessels（cluster 5）不明显，主要表现为AV mesenchyme（cluster 6）。如下图所示。

单细胞转录组：研究人员选取了6.5-7周的样本（分为上下两部分）做了单细胞转录组，采用了10X Genomics Chromium workstation。（为什么还要再做一个单细胞转录组呢？因为作者做的空间转录组分辨率不能达到单细胞水平，一个spot中大约有30个细胞。推荐老师们们有需要的时候也加上一个单细胞转录组，提高细胞分辨率）。研究人员选取了另外一份6.5-7周的心脏作为对应空间转录组实验的样本的生物学重复（大概是切过10片切片之后不够做单细胞了），并计算了两者的相关性，r=0.93来证明用另一份样本做生物学重复的合理性。最后得到15个亚群，并根据maeker gene的表达定义了这些亚群，更多的亚群集中在心脏上半部分，显示了心脏上部有丰富的细胞多样性。见下图。

    综合空间转录组和单细胞转录组的结果，作者最终筛选出来69个基因作一个panel，通过这69个基因就能回溯到原始的cluster中。作者还做了Rolling circle amplification (RCA) and in situ sequencing (ISS) 和Single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH)作为验证，感兴趣的老师可以去看原文。

    了解了基本原理，老师们可以想想怎么把这个新技术运用到自己的研究中，解决我们科研中的问题。