实验步骤：  

1设计sgRNA

按照“20N+NGG(PAM)”的设计原理设计sgRNA，至少设计3条。

2构建sgRNA和dCas9-target 质粒

3、构建dCas9-target稳转株

稳转株蛋白构建完成后，用flag抗体或目的蛋白抗体检测稳转株是否构建成功，如果载体上有荧光蛋白，可用荧光检测细胞株是否构建成功。

图3 荧光检测图片  A转染筛选后明场图片   B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

4、Flag-ChIP-QPCR验证sgRNA的工作效率

实验问题与解决方案

1怎样避免sgRNA脱靶?

脱靶效应与sgRNA的精确设计有着密切的关系，一般的sgRNA设计网站都会给出设计序列相应的脱靶位点、GC含量或综合得分。

我们一定要选择综合得分高和脱靶位点少的sgRNA序列，且一般至少设计3条sgRNA。

2怎样选择CRISPR系统？

如果要靶标多个基因位点，建议您选择CRISPR-cpf1系统，这个系统的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上，一个sgRNA载体可同时插入多个sgRNA。

如果要更精确的编译基因组，建议选择Cas9 nicknase，这个蛋白是Cas9的突变体，只切割DNA的一条链，因此，这个系统需要设计两个sgRNA，同时切割，才能产生DNA双链缺口。同时，这种方法大大降低了脱靶效应。

3 Cas9的单切系统和双切系统是什么？

Cas9的双切系统是未突变的Cas9内切酶，Cas9内切酶可以切割双链DNA。Cas9

的单切系统使用的是单突变Cas9内切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要两套才可以切割双链DNA。

4 怎样选择CRISPR系统的质粒？

 如果您的细胞的转染效率较高，可使用普通载体，如果您的细胞不容易转染，建议使用腺病毒或慢病毒载体。