1840年鸦片战争年代，马相伯出生在江苏丹阳，也就是现在镇江的马家村，一个信奉天主教的世家，父亲既是商人又是医生，母亲对于天主教更是诚笃。因此，马相伯出生1个月，就接受了天主教的洗礼，他小时的为人处世、德行智识更是严遵天主教的标准。
受到自己父亲的影响，马相伯5岁就进入私塾学习四书五经，这也为他日后的发展打下了坚实的文学基础。
天资聪颖的马相伯熟读国学，又对数理天文兴致浓厚。就在他12岁那年，由于不满足私塾教授的内容单一，一个小孩竟不辞而别，只身一人整整步行了11天，辗转到了大上海，进入天主教耶稣会所办的徐汇公学, 学习中西文化和综合学科知识。十余年间，寒窗苦读的马相伯，精通拉丁文、希腊文、英文等七国文字，并攻读了哲学、神学、天文学、物理学等学科，可谓是上知天文下知地理，学贯中西。
18岁那时，他在通读法文通史时，看见书上赫然写着：“中国民族不配在天地之间呼吸空气！”这使得他愤慨不已，心中种下了爱国救国的种子。
而他一贯主张科学知识为世人所用，不应分中西。
22岁那年，马相伯进入了耶稣会在上海创办的神学院，并顺利成为一名修士。期间，他博览群书，以其过人的勤奋和钻研精神，继续深造学习。并在1870年，以特优成绩通过耶稣会的考试，成为中国第一批获得神学博士学位，正式成为天主教徒，并开始以神父的身份传教。作为天主教徒，在30几岁的青春年华里，马相伯传播信仰理念，启迪世人思维。
两年后，马相伯接受了教会安排，担任徐汇公学校长。
就在他担任徐汇公学校长期间，马相伯不仅传授学科知识，并且开展了中国传统文化课程的学习，还鼓励学生参与科举考试。他本意想要推动中西文化的融会贯通，却不曾想过这一举动引起教会的不满，并撤了他校长的职位，调他到天文台研究数理。这让他倍感沮丧和愤怒。
有一次，外国传教士来华，教会竟然安排马相伯搬出原本居住的房间，让位给新的传教士，这也让他感受到了歧视，一次又一次地对教会深感失望。
虽然身在教会，他也不只考虑传教，非常关心百姓的生活，心存善念。1876年，徐州发生了水灾，马相伯找到了兄长马建勋，筹措了几千白银救济灾民。没想到这样的善举却被教会认定为擅自动用了教会的钱物，触犯了“教规”，需处罚幽禁。这更让马相伯感觉心寒。
随着马相伯的才华和声望越来越高，他与教会的矛盾也越来越频繁。多重事件的打击下，马相伯内心失去了平静，也失去了继续留在教会发展的机会，最终毅然决然离开了基督会。
此时的中国，正在经历第二次鸦片战争，马相伯深感国人所受的屈辱和欺压，怀抱志向的他也想让中国发展起来，让国人振作起来。于是投身到当时的洋务运动，试图以自身的才华和热血来救国图强。
壮志满怀，却在权力斗争中败下阵来
虽然马相伯长期在教会中学习和工作，但并非两耳不闻窗外事，国难当头，他也渴望能寻求到改革的道路。凭借他精通七国语言，并修读多学科的智识，当即被李鸿章重用。1881年，马相伯受李鸿章委派出使日本，与日本维新派接触，并发表演说。因为马相伯擅长演说，也因此多次受邀参与讲演，被日本上流社会所熟知。
在出访多国之后，马相伯西学东用，他深知国家要想富强，就必须走科学发展的道路，提倡兴办实业。1886年，眼看清王朝已无法支持洋务运动，马相伯凭借自己开放的思想、专业的知识、新颖的外交理念，大胆向李鸿章提出向美国商人借款，解决北洋水军的经费问题，并大力发展当时的实业。李鸿章遂批准马相伯等人前往美国洽谈两千五百万两的借款事宜。当时美国商人也看到了中国的投资市场潜力，借款事宜进展极其顺利。短时间内，他便筹集到了5亿多的借款。马相伯深知这5亿相比起期望的两千五百万，实在是超出太多了。为了降低借款利息，以及让借款本金与预期不至于差异过大，马相伯提议借款五千万，3亿转为美国在中国开办银行的存款。但是，本次的借款事宜却被清政府扣上了与外国人勾结私下交易的帽子。这对他来说，无异于卖国求荣，借款事宜就此告终。
1895年，中日甲午战争爆发，作为翻译的马相伯本来想着施展才华救国，在谈判桌上唇枪舌剑为中国争取最大的利益，却无奈又悲愤地跟着李鸿章签订一个个不平等条约，清政府与日本签订了丧权辱国的《马关条约》，中国开始蒙受着百年未有之奇耻大辱。不只是李鸿章，马相伯也被国人唾弃，被世人说成卖国贼。
加上1893年，马相伯的妻儿在回山东省亲的路上，遇到海难，死于海上。妻儿逝世后，他的母亲又在临终前哀叹，她的儿子都是神父，现在只有马相伯现在不是神父。她不愿意认他这个儿子。从政之路的阻塞，至亲离世等多重打击之下，马相伯愤然离开了政坛，重回教会，过上了半隐半俗的生活。
年近古稀，为了救国排除万难开办学校
在鸦片战争、甲午战争后，国家的水深火热，令马相伯深深地感到，国家要自强，需要以育人为本；想要救才，尤其需要以设立学堂为先，并当即决定毁家兴学。
1900 年，马相伯将名下的财产，3000亩田地和大量银两捐给教会，要求用作兴办中西学堂的学生助学金。但是教会却迟迟没有兑现承诺，没有开办学堂之意。
1902年，在南洋公学任职的蔡元培为了要学习拉丁文，决定拜马相伯为师。马相伯认为一个人学，不如多人共同学习，毕竟学习一门语言是长期的探索，于是有了第一期24人的拉丁文班级。马相伯不仅教授拉丁文，还教授数学和哲学。很快，吸引了社会各界人士前来求学。马相伯也意识到，开办中国式学堂一事不容耽搁，随即找到了基督教会，洽谈开办大学一事。
第二年，马相伯联合耶稣教会创办了中国近代第一所私立大学——震旦学院。震旦在梵文中表示“中国”，也有日出东方、威震东方之意。震旦学院秉持着崇尚科学、注重文艺、不谈教理的三原则，鼓励学生独立、自主、创新。也正是这样有教无类的理念，马相伯一边使教学活动风生水起，另一方面，他却遭受到教会的严厉打击，因为他的教学理念违背了教会的原则，也威胁了教会的监管，基督教希望震旦学院是教会学校，而非世俗学校。
因此，教会胁迫马相伯无病入院，其学生激动愤懑、集体退学。学生们在医院中拜见马相伯先生，大家都表示：不愿去教会学校上学，但内心特别渴望读书。马相伯也忍不住心疼学生，瞬间老泪纵横，可叹我们中华这泱泱大国，难道一张小书桌都难容吗？
1905年，在大家奔走游说筹款之后，终于在中秋节前后，由65岁的马相伯、一百多名学生、一块黑板组成的，第一所由中国人独立创办的复旦公学成立了。复旦一词出自《尚书》：“日月光华，旦复旦兮。”意思就是光复震旦、光复中华。在这么简陋的环境下，这所大学先后培养出了民主革命的先驱者于右任、著名教育家北大校长蔡元培、气象学家竺可桢、艺术大师李叔同、国学大师陈寅恪（kè）、数学家胡敦福、中国第一任工业部部长黄炎培、政治家和教育家邵力子等，马相伯也被称之为“大师们的大师”
后来，马相伯依旧在办学道路上孜孜不倦，相继创办了辅仁大学、震旦女子文理学院、培根女校，以及启明女子中学。
为了救国，马相伯排除万难，开办学校，为中国的高等教育做出了卓越的贡献，开创了中国“学术独立、思想自由”教育的大河。
然而，1931年爆发的九·一八事变再一次打碎了马相伯的希望。已经亲历鸦片战争和甲午战争的他，92岁的高龄，依旧以残躯奔走在抗战的最前线，用自己的字画为抗日义勇军筹集资金。后来日寇攻陷上海，马相伯被迫流亡，最终因病留居，客死他国。
马相伯在其百岁的生命中，生于鸦片战争，归于抗日战争时期，如此黑暗动荡的年代，他依然一辈子都在坚持爱国主义、民族主义、民主主义不动摇，为救国奋斗终身。
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