DNA甲基化属于表观遗传学内容，在医学各个领域（维持正常细胞功能、胚胎发育以及人类肿瘤发生）都能看到他的身影。是近年来新的研究热点之一，并且热度一直不下。你是不是也对它垂涎已久？跃跃欲试？但是低分文章千篇一律，毫无新意。高分文章又过于晦涩。其实甲基化的研究其实并没那么难，快来学习一下吧！
背景知识
结直肠癌(CRC)是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一。免疫疗法在治疗可切除和不可切除的结直肠癌方面发挥着越来越重要的作用。免疫检查点抑制剂可促进T细胞攻击肿瘤细胞，延长患者生存期。CD8+TIL（肿瘤浸润性淋巴细胞）以细胞毒的方式杀伤肿瘤细胞，并被认为影响大肠癌的预后、免疫治疗反应和生存结局。DNA甲基化是组织特异性的，在组织分化中起着决定性的作用。因此，DNA甲基化在不同组织和器官的细胞中是不同的，它有可能成为识别不同细胞的标志物。其中，中等CpG密度区的甲基化是高度保守的，可以区分不同来源的组织类型。此外，在淋巴细胞激活和增殖过程中，部分甲基化区域(PMD)会发生低甲基化，在这些区域中CpG的甲基化可能会将免疫细胞与其他免疫细胞区分开来，这可以通过solo-WCGW来预测。对此，作者开发了一种新的检测方法，通过利用这些低CpG密度的甲基化来开发生物标记物。
SAH-SYSU：中山大学第六附属医院。CCFR：结肠癌家族登记处
文章简介
这篇文章1发表在期刊: Journal for Immunotherapy of Cancer这篇杂志在最近一年的影响因子为13.751比上一年增加了3.838。在这项研究中，作者的目的是分析免疫细胞和结肠上皮细胞的全基因组DNA甲基化图谱，以确定CD8+T细胞特异的差异甲基化位点(DMP)。然后，我们通过使用这些DMP构建CD8+MeTIL签名评分来评估CD8+TIL和大肠癌和其他癌症的生存结果。
小编解析思路：
结果解读
结直肠肿瘤中CD8+TIL的DNA甲基化特征
图1. 本研究中模型生成和队列配置的流程图。
为了开发CD8+MeTIL特征，作者首先利用EPIC阵列分析的基因组甲基化数据，将CD8+T细胞与癌变和正常大肠上皮细胞以及其他人类来源的免疫细胞(包括CD4+T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞)的甲基化特征进行了比较。在这一发现步骤中，作者鉴定了73个CD8+T细胞特异性的DMP（甲基化位点），它们在CD8+T细胞和其他细胞之间高度甲基化(figure 2A)。为了证实发现步骤中的结果，作者分析了这些CD8+T细胞特异性DMP的生物学特性。大多数CPGS位于基因内区(80.6%，59个探针)，包括CD8A、CD8B、CD96等CD8+T细胞的功能基因，少数为基因间CPGS(19.2%，14个探针。将这些基因作GO分析(figure 2C)。这一发现证实了已鉴定的CpGs与CD8+T细胞有很强的相关性。接下来，作者对这73个CpGs的基因组特征进行了分析。CpG多位于低密度区(60.3%，44个探针)和中等密度区(34.2%，25个探针)，少数(5.5%，4个探针)位于高密度区(CpG岛) (figure 2B)。作者使用无监督聚类分析，通过评估这三种CpGs，CD8+T细胞可以很好地与其他类型的细胞区分开来(figure 2D)。CD8+T细胞的CD8+MeTIL评分明显低于癌和正常大肠上皮细胞、CD4+T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞(figure 2E)。CD8+T细胞中CD8+MeTIL评分的高度特异性是其确定肿瘤中CD8+T细胞丰度的基础。此外，作者还用免疫细胞、癌变和正常结肠上皮细胞以及肿瘤微环境中识别的其他细胞类型的DNA甲基化图谱，在一组独立样本中验证了CD8+MeTIL评分的特异性。作者接下来探索CD8+MeTIL评分中三个CpGS的甲基化特征与临床病理特征之间的关系(figure 2F)。作者发现，CD8+MeTIL评分较低且甲基化较少的三种CpGS与低频率的微卫星不稳定性(MSI-H)、右侧定位和高分化的大肠癌相关。这些结果与之前基于IHC的CD8+TIL相关性研究结果一致。EPIC阵列测定的这三种CpGS的甲基化水平与亚硫酸氢盐焦磷酸测序测定的甲基化水平显著相关(figure 3D)。
图2使用CD8+T细胞特异性DMPS生成CD8+MeTIL评分。
基于qPCR的CD8+MeTIL单碱基分辨率分析
为了容易地获得从基于阵列的分析中产生的CD8+MeTIL分数，作者开发了一种基于qPCR的分析方法(QASM)。如figure 3A所示，每个CpG的甲基化和非甲基化等位基因在探针水平上被量化，其中甲基化百分比可以由两个探针的信号比来确定。为了验证这种基于qPCR的方法确定CD8+MeTIL评分的有效性，作者接下来将QASM分析的结果与SAH-SYSU队列中的EPIC阵列和pyrosequencing的结果进行了比较(figure 3B)。此外，QASM法测定的甲基化百分率与pyrosequencing测定的甲基化百分率呈线性相关(figure 3C)。因此，QASM法是测定CD8+MeTIL评分的一种可靠的技术手段。为了用CD8+MeTIL评分测定CD8+TIL的分布，作者首先用QASM方法检测了结直肠癌组织(n=45)及其周围正常组织(n=44)、正常(NCM460)和癌变(RKO、SW48、HCT8和HCT15)结肠上皮细胞系和代表结直肠癌组织主要成分的多种免疫细胞(CD4+T细胞、单核细胞和B细胞)中3种CpGS的甲基化百分率。QASM分析显示CD8+T细胞与其他细胞相比CD8+MeTIL评分明显降低（figure 4A)。并且与EPIC阵列数据集确定的结果一致，进一步支持基于qPCR的CD8+MeTIL评分可以作为基于阵列的评分的准确替代，以确定肿瘤样本中CD8+T细胞的丰度。
图3.基于定量PCR的QASM法在单碱基分辨率下测定CD8+MeTIL评分。
用CD8+MeTIL评分评价CD8+TIL在大肠癌中的分布
作者应用这种基于qPCR的CD8+MeTIL评分来评估肿瘤组织中的CD8+TIL，并将其与SAH-SYSU队列中IHC染色测定的CD8+TIL(CD8+PaTIL)进行比较(figure 4B,C)。CD8+PATIL与CD8+MeTIL评分呈显著负相关。但是值得注意的是，在免疫组化染色组中，低甲基组的CD8 + TIL数量比高甲基组的多（figure 4C)。作者检测了编码CD8抗原的CD8B基因在SAH-SYSU队列中的mRNA表达。CD8+MeTIL评分与CD8B基因表达特征呈显著负相关(figure 4D)。接下来，作者根据CCFR队列中大肠癌患者的分子特征，对QASM法测定的CD8+MeTIL评分的分布进行评估。MSI-H组CD8+MeTIL评分明显低于低频微卫星不稳定(MSI-L)/微卫星稳定(MSS)组（figure 4E)。
图4.使用CD8+MeTIL评分评估细胞系和肿瘤样本中CD8+TIL
CD8+MeTIL在大肠癌和多发性肿瘤中的预后价值
评分在预测大肠癌预后中的作用。在SAH-SYSU和CCFR中，CD8+MeTIL评分低的患者与CD8+MeTIL评分高的患者相比，OS明显好于CD8+MeTIL评分高的患者(figure 5A和5C中)。接下来，作者探讨CD8+MeTIL评分是否可以在标记物预测分析中进一步对MSI-H/MSI-L/MSS患者进行分层。在生存分析中，根据SAH-SYSU和CCFR队列中的MS状态和CD8+MeTIL评分对患者进行分组。正如预期的那样，死亡风险可以通过CD8+MeTIL评分进一步分层(figure 5B,D)。接下来作者利用TCGA中450K甲基化阵列数据对其他癌症类型进行了生存分析。在24种癌症类型(肺腺癌(p=0.033)、肺鳞癌(p=0.038)、结直肠癌(p=0.048)、宫颈鳞癌(p=0.044)、乳腺浸润性癌(p=0.011)和肾上腺皮质癌(p=0.033))中，低cd8+metIL评分与较好的生存结果显著相关。在24种癌症类型(肺腺癌，p=0.033)中，CD8+ MeTIL评分较低与较好的生存结局显著相关(p=0.048)，宫颈鳞癌(p=0.044)，乳腺浸润性癌(p=0.011)和肾上腺皮质癌(p=0.033) (figure 5E)。综上所述，这些数据表明CD8+MeTIL评分可以预测多种癌症的生存结果。
图5 CD8+MeTIL在大肠癌和多发性肿瘤中的预后价值。
全文总结
在这项研究中，作者分析了全基因组DNA甲基化图谱，以确定CD8+T细胞特异性DMP，并构建了CD8+MeTIL评分来评估结直肠癌中CD8+TIL。作者通过显示CD8+MeTIL签名与基于IHC的CD8+PaTIL和CD8+ExTIL签名的紧密关联，证明了CD8+MeTIL签名在评估基于CD8+TIL的免疫应答方面的可靠性。此外，作者开发了一种基于qPCR的QASM方法，可以在单碱基分辨率下有效地确定CD8+MeTIL评分，从而能够以定量的方法评估CD8+TIL。最后，作者在两个大肠癌队列中验证了CD8+MeTIL对微卫星不稳定性(MSI)/MSS状态和预后结果分层的能力，并从TCGA肿瘤的泛癌分析中确定了与提高几种癌症生存率的相关性。
参考文献
1.Zou Q, Wang X, Ren D, et al. DNA methylation-based signature of CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes enables evaluation of immune response and prognosis in colorectal cancer. J Immunother Cancer 2021; 9(9).
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