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“每逢佳节胖三斤”，又到了和浑身的肉肉斗智斗勇的时候。今天，我们就来仔细的研究下自己的肉肉吧。
摘要：阻断β-肾上腺素能受体（β-AR）信号通路后，寒冷刺激依然能够诱导米色脂肪生成，且这种米色脂肪表现出较强的糖氧化能力。
我们知道，哺乳动物的脂肪组织主要分为两种，白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）和棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT），前者用于储存能量，后者用于产热耗能。近年来发现，在寒冷刺激下或激活β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor, β-AR），白色脂肪可发生棕色样变，形成可以产热耗能的米色脂肪（beige fat），因此诱导米色脂肪产生在治疗肥胖、糖尿病等代谢性疾病方面有极好的应用前景。然而由于β-AR激动剂可引起高血压、增加心血管疾病风险，严重限制了β-AR激动剂作为抗肥胖药物的应用。那么能不能绕过β-AR信号通路促进米色脂肪产生呢？
2018年12月19日美国加州大学旧金山分校糖尿病中心的Shingo Kajimura教授团队在Nature杂志上发表了题为Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state的研究成果，发现阻断β-肾上腺素能受体信号通路后，小鼠腹股沟WAT出现生肌细胞，寒冷刺激则可诱导此生肌细胞转化为一种糖酵解能力明显增强的米色脂肪。这一发现让胖子们看到了希望，下面我们一起学习一下吧。只想了解大概套路的同学可直接滑到最后，查看文末的学霸笔记。
背景介绍
脂肪的分类
如下图所示，哺乳动物的脂肪组织可分为三种，白色脂肪组织（WAT）就是我们通常看到的白花花的肥肉，分为皮下脂肪和内脏脂肪。白色脂肪细胞大而饱满，细胞中央有一大脂滴，线粒体含量较少，主要用于储存能量。棕色脂肪细胞内则散在分布许多小脂滴，含有丰富的UCP1+线粒体，可以产热。在寒冷或β-AR激动剂刺激下，白色脂肪组织可发生棕色化，生成米色脂肪。米色脂肪细胞的特征与棕色脂肪细胞相似，也含有大量的UCP1+线粒体，可以产热，然而其主要散落于白色脂肪中。
小鼠的白色脂肪、棕色脂肪、米色脂肪示意图。
脂肪组织的血管基质部分
脂肪组织中的血管基质部分（stromal vascular fraction, SVF)是脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到的。SVF含有丰富的、具有多向分化潜能的脂肪组织来源的间充质干细胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ASC)，因此可塑性极强。WAT来源的SVFc可在特定的环境下分化为成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、造血细胞和心肌纤维细胞，相比之下，BAT来源的SVF可塑性较弱。小鼠腹股沟WAT是可塑性最强的脂肪组织，可作为提取干细胞进行细胞治疗的取材部位。
CreERT2和Rosa26-mTmG小鼠
CreERT2小鼠是一类表达雌激素受体（estrogen receptor，ER）的配体结合区突变体（ERT）与Cre重组酶的融合蛋白的小鼠。CreERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使CreERT2进核发挥Cre重组酶活性。利用不同的启动子，可以在不同组织或细胞中特异性调控表达Cre。
Rosa26-mTmG： mTmG是一种红绿荧光报告系统，正常情况下在细胞膜表达红色Tomato荧光，在有Cre重组酶的情况下，会变成绿色GFP荧光。Rosa26为外源基因插入位点。Rosa26-mTmG小鼠是一种常用的报告小鼠，通过红绿荧光直观显示小鼠是否发生了Cre重组。
方法与结果
1 阻断β-AR促进WAT生成生肌细胞
前文中有提到，WAT在寒冷或β-AR激动剂刺激下可生成米色脂肪细胞，产热耗能，因此β-AR可作为肥胖和糖尿病的潜在治疗靶点。然而因为β-AR激动剂可引起高血压，严重限制了其使用，因此作者想探究阻断β-AR信号通路后，机体是否存在生成米色脂肪的代偿通路。
作者首先构建了一种β-less小鼠模型，即把三种β-AR全部敲除，然后将其暴露于15℃环境中（小鼠正常饲养温度为18~28℃），发现β-less鼠腹股沟WAT仍有米色脂肪组织生成，那么在缺乏β-ARs的条件下，小鼠是通过什么途径生成米色脂肪的呢？
作者将β-less鼠和WT对照鼠的腹股沟WAT进行RNA-seq和聚类分析，确认了三个gene set：gene setⅠ是WT鼠和β-less鼠暴露于寒冷后基因发生同样变化的基因集，主要包括棕色脂肪产热、呼吸链电子传递和脂肪酸代谢相关基因，冷刺激后，其表达水平均升高；gene set Ⅱ和Ⅲ是仅在β-less鼠中发生明显变化的基因，GO分析显示其主要为线粒体翻译、三羧酸循环、横纹肌收缩和葡萄糖代谢。WAT中为什么会有横纹肌收缩相关基因表达，而且冷刺激后发生明显变化呢？
作者检测了β-lesss鼠肩胛骨棕色脂肪组织（iBAT）、腹股沟WAT及骨骼肌组织中骨骼肌相关基因的表达，发现室温下β-less鼠WAT的骨骼肌相关基因，如Myh1、Myl1等，表达明显升高，冷刺激后，表达明显降低，iBAT和骨骼肌组织中的骨骼肌相关基因则一直无明显变化。
为了排除β-less鼠WAT中骨骼肌相关基因高表达是由于β-AR敲除的组成性缺陷所致，作者用β- blocker阻断WT小鼠的β-AR信号通路，观察到同样的结果。同时作者观察到β-blocker鼠WAT的部分基质细胞表达MyoD蛋白，而vehicle处理组没有表达。来自β-blocker鼠的基质细胞在成脂诱导培养基中可融合成表达MHC的多核肌管，并在分化的第6天发生收缩，vehicle处理鼠则没有观察到MHC+肌管。
作者用Myod1-CreERT2;Rosa26-mTmG报告小鼠追踪β-blocker鼠腹股沟WAT的MyoD+细胞是如何产生的，发现阻断β-AR后，腹股沟WAT的SVF先出现单核的MyoD+细胞，然后融合形成MyoD+肌管。
此图为原文Fig. 1。图a为β-less鼠和WT鼠在23℃和15℃时进行转录组测序和聚类分析。图b为图a中gene set Ⅱ和Ⅲ的GO分析。图c显示β-blocker鼠和vehicle鼠的腹股沟WAT 的SVF细胞MyoD表达情况。图d显示成脂诱导培养基培养的SVF基质细胞MHC表达情况，图e是对图d的定量。图g显示Myod1-CreERT2小鼠腹股沟WAT的SVF细胞表达GFP+ MyoD蛋白，图f显示Myod1-CreERT2小鼠腹股沟WAT基质细胞在成脂诱导培养基中表达GFP+MHC+肌管。
2 发现糖酵解米色脂肪
上述结果显示，阻断β-AR后小鼠腹股沟WAT出现MyoD1+细胞。一般情况下，MyoD1+谱系细胞不会分化成白色或棕色脂肪细胞，那么这些MyoD1+细胞是干嘛用的呢？
作者用Myod1-CreERT2；Rosa26-mTmG小鼠进行了如下图a所示的实验，发现冷刺激5天后β-blocker组和vehicle组小鼠腹股沟WAT产生大量的UCP1+米色脂肪细胞。且作者发现β-blocker组小鼠的部分UCP1+米色脂肪细胞来源于Myod1+谱系，而vehicle组小鼠没有Myod1+来源的米色脂肪细胞。因为β-blocker组的GFP+米色脂肪细胞不表达MyoD蛋白，但又起源于Myod1+前体细胞，所以作者将其命名为Myod1+来源的米色脂肪细胞。Myod1+来源的米色脂肪细胞占β-blocker组UCP1+米色脂肪细胞的14.8%±2.5%左右。β-blocker小鼠的iBAT和附睾WAT则未发现Myod1+来源的米色脂肪细胞。
有意思的是，即使不用β-blocker预处理，将老鼠暴露于6℃ 2周，也可诱导Myod1+来源的米色脂肪细胞产生。然而用β3-AR激动剂处理老鼠2周，却没有Myod1+来源的米色脂肪细胞产生，说明Myod1+来源的米色脂肪细胞的产生不依赖于β3-AR信号通路。
以上说明小鼠腹股沟WAT存在表达Myod1的独特前体细胞，当阻断β-AR通路后，冷刺激可诱导其分化为米色脂肪细胞。
这种Myod1+来源的米色脂肪细胞与普通米色脂肪细胞有什么不同吗？
作者分离β-blocker小鼠腹股沟WAT的 Myod1+来源的米色脂肪细胞、非Myod1+来源的米色脂肪细胞、棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞进行转录组测序，结果显示Myod1+来源的GFP+脂肪细胞大量表达棕色或米色脂肪细胞标志物，如Ucp1和Kcnk3，而不表达骨骼肌细胞特异性的基因Myh1和Myog，因此认定Myod1+来源的GFP+脂肪细胞为米色脂肪细胞。主成分分析（PCA）显示Myod1+来源的米色脂肪细胞呈现出与非Myod1+来源的米色脂肪细胞不同的分子特征。与非Myod1+来源的米色脂肪细胞相比，Myod1+来源的米色脂肪细胞高表达糖酵解、糖代谢相关基因，如Eno1和Pkm2。这些糖酵解相关基因在冷刺激的β-less鼠的腹股沟WAT中也高表达。
转录组学结果提示Myod1+来源的米色脂肪细胞可能糖代谢能力增强。与此一致的是，作者发现Myod1+来源的米色脂肪细胞大量表达糖酵解细胞的标志物烯醇酶1（enolase 1, ENO1），而且与非Myod1+来源的米色脂肪细胞相比，Myod1+来源的米色脂肪细胞糖氧化、细胞外酸化速率（extracellular acidification rate, ECAR）明显增强，而脂肪酸代谢和耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）无明显差别。
以上提示阻断β-AR后，冷刺激促进小鼠腹股沟WAT生成一种新型米色脂肪细胞，这种细胞的糖代谢能力明显增强，因此作者将其命名为糖酵解米色脂肪细胞（glycolytic beige fat, g-beige fat）。
此图为原文Fig. 2。图a为实验方案图。图b为小鼠腹股沟WAT的GFP和UCP1免疫荧光染色。图c为图b中GFP+细胞与UCP1+细胞比值的定量。图d显示对细胞进行转录组主成分分析的结果。图e是对图d中GFP+米色脂肪细胞进行GO分析。图f和图g分别显示β-blocker鼠和β-less鼠冷刺激后糖代谢相关基因的表达情况。图h显示米色脂肪细胞表达糖酵解细胞标志物ENO1的情况。图i-j分别显示GFP+和GFP-米色脂肪细胞糖氧化、ECAR和OCR的情况。
3 糖酵解米色脂肪前体细胞的特征
前面证明小鼠腹股沟WAT存在表达Myod1的独特前体细胞，那么这种独特的前体细胞是怎么来的呢？
会不会是既往存在的MyoD+前体细胞增殖的结果？作者用BrdU增殖实验检测β-blocker小鼠室温下MyoD+前体细胞的BrdU摄入速率，未发现其摄入BrdU，说明其未发生细胞增殖。
Pax7是参与骨骼肌生长和分化的一个重要基因，然而免疫荧光显示MyoD+前体细胞不表达Pax7，说明其不是Pax7谱系分化的结果。
转录组测序数据显示，其分子特征也不同于成肌细胞和成脂成纤维前体细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）。
然而GFP+前体细胞表达Pdgfra, Cd34和Cd29，这些都是脂肪前体细胞的标志物，作者就猜想PDGFRα+CD34+CD29+脂肪前体细胞会不会表达MyoD？作者构建了Pdgfra-CreERT报告小鼠，发现β-blocker处理后，小鼠腹股沟WAT的10.4%±0.8%的GFP+CD34+CD29+脂肪前体细胞表达MyoD蛋白，说明MyoD+细胞可能来源于PDGFRα+CD34+CD29+脂肪前体细胞。
为了确认MyoD+前体细胞的上游信号通路，作者对其转录组数据进行IPA（Ingenuity pathway analysis）分析，发现其高表达骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）。这与MyoD+前体细胞大量表达Smad5和Bmpr1b（一个BMP受体）一致。
因为BMP7是一个公认的可以促进棕色脂肪产生的因子，作者便检测BMP7能否促进MyoD+前体细胞生成米色脂肪细胞，结果显示rBMP7预处理的MyoD+前体细胞可以生成包含大量脂滴的脂肪细胞，而未加rBMP7预处理的MyoD+前体细胞则分化成肌管。
此图为原文Fig. 3。图a对小鼠骨骼肌细胞和腹股沟WAT的GFP-Lin-细胞及GFP+lin-细胞进行转录组测序。图b显示细胞表达生肌细胞标志物Myod1、CD56和脂肪前体细胞标志物Pdgfra、Cd34、Cd28的情况。图c为实验方案图。图d是将图c中的老鼠的SVF细胞进行MyoD和GFP免疫荧光染色。图e是图d的定量。图f是GFP+前体细胞转录组数据的IPA分析。图g是rBMP7或vehicle预处理的MyoD+基质细胞在成脂诱导培养基中分化数天后进行GFP免疫荧光染色和Nile red染色。
4 GABPα控制糖酵解米色脂肪细胞的发育
上面探究了糖酵解米色脂肪前体细胞的起源，那么糖酵解米色脂肪前体细胞又是如何分化为米色脂肪的呢？
作者对Myod1+来源的米色脂肪细胞和β-less鼠冷刺激后生成的米色脂肪细胞转录组数据进行HOMER（hypergeometric optimization of motif enrichment）分析，发现两者都明显富集GABPα(GA-binding protein α)、ERRα(oestrogen-related receptor α)和ERRγ(oestrogen-related receptor γ)结构域。作者在C2C12生肌细胞中过表达上述每个因子，看哪个转录因子能诱导MyoD+前体细胞分化为米色脂肪细胞，结果发现过表达GABPα的细胞最有效地分化为脂肪细胞，且其分化效率可与过表达PRDM16（控制棕色脂肪生成的一个关键转录因子）的细胞媲美。与产热脂肪细胞相似，过表达GABPα的脂肪细胞在毛喉素刺激下显著高表达产热基因，如Ucp1和Pgc1a。此外，过表达GABPα的细胞高表达ENO1，PPARγ和UCP1，而Myod1基因的表达降低。在功能水平上，与对照组相比，过表达GABPα的细胞表现出更高水平的葡萄糖摄入和氧化及ECAR，而脂肪酸代谢和OCR无明显差异。
以上提示GABPα促进MyoD+前体细胞分化为糖酵解米色脂肪细胞，为使该结论更可信，作者又敲除GABPα进行反证。
敲低GABPα后，MyoD+前体细胞分化为糖酵解米色脂肪细胞的能力严重受损，脂肪细胞相关基因，如Ucp1, Adipoq和Fabp4的表达明显下降，而生肌相关基因，如Myh1和Myod1的表达明显增加。功能水平上，敲低GABPα的细胞的ECAR和OCR水平较对照组也明显下降。
接下来作者在体内验证GABPα对糖酵解米色脂肪细胞分化的作用。作者构建Myod1+细胞特异性地敲除GABPα的报告老鼠（GabpaMyod1-KO, Myod1-CreERT2; Gabpaflox/flox; Rosa26-mTmG），β-blocker预处理和冷刺激后，对照组可正常形成GFP+UCP1+的糖酵解米色脂肪细胞，而敲除GABPα的老鼠只观察到GFP-UCP1+的米色脂肪细胞，未观察到GFP+UCP1+的糖酵解米色脂肪细胞。
以上有力地证明GABPα对于糖酵解米色脂肪细胞的发育是必需的。
此图为原文Fig. 4。图a显示β-less鼠和MyoD来源的糖酵解米色脂肪的转录组HOMER结构域分析的结果。图b显示过表达空载体或相应转录因子的C2C12细胞在成脂诱导培养基条件下进行油红和BODIPY染色。图c显示过表达相应转录因子的C2C12细胞表达脂肪细胞基因的情况。图d显示毛喉素刺激（可引起cAMP升高）的过表达GABPα的细胞表达产热基因的情况。图e显示过表达GABPα的C2C12细胞表达肌细胞标志物MHC和糖酵解细胞标志物ENO1的情况。图f-h显示过表达相应转录因子的C2C12细胞ECAR、糖氧化和脂肪酸氧化的情况。图i显示GabpaMyod1-KO老鼠和对照组老鼠腹股沟WAT的GFP和UCP1免疫荧光染色情况。GFP指示的是Myod1。图j是图i的定量。
5 糖酵解米色脂肪在代谢中的作用
前面证明糖酵解米色脂肪不同于一般的米色脂肪，其糖代谢能力明显增强，那么其在代谢中有什么作用呢？
作者构建了糖酵解米色脂肪缺陷的老鼠模型，即Myod1-CreERT2;Rosa26-DTR鼠（Myod1-DTR+），该鼠可通过给予白喉毒素特异性地敲除Myod1+来源的细胞。作者将Myod1-DTR+鼠和同窝的对照鼠用β-blocker预处理后暴露于15℃环境中，两组老鼠均生成糖酵解米色脂肪细胞。然而用白喉毒素处理后，Myod1-DTR+鼠的糖酵解米色脂肪细胞数量明显减少，腹股沟WAT的葡萄糖摄入量、OCR和ECAR均明显降低。
考虑到白喉毒素可能会影响肌肉的功能，作者又构建了另一种糖酵解米色脂肪缺陷的老鼠模型，即在Myod1+来源的细胞中敲除PPARγ（PpargMyod1-KO）。与Myod1-DTR+鼠的结果一致，PpargMyod1-KO鼠腹股沟WAT的ECAR和OCR水平也明显降低。这些数据说明寒冷刺激下，糖酵解米色脂肪细胞有助于小鼠腹股沟WAT摄入葡萄糖和产热。
接下来作者检测糖酵解米色脂肪在适应性产热和全身糖稳态中的作用。
没有用β-blocker预处理的WT小鼠用急性β-blocker处理后置于10℃，因为急性β-blocker阻断了iBAT的生成，没有用β-blocker预处理，也没有糖酵解米色脂肪生成，小鼠很快发生了低体温症，而β-blocker预处理过的小鼠再用急性β-blocker处理后暴露于10℃，可在10℃维持核心体温4h，提示β-blocker预处理过的小鼠可能依靠糖酵解米色脂肪产热。而糖酵解脂肪缺陷的小鼠PpargMyod1-KO，用β-blocker预处理后置于15℃，其核心体温和全身氧耗略低于对照组，暴露于10℃则很快发生严重的低体温症，进一步证明阻断β-blocker后小鼠主要依靠糖酵解米色脂肪产热。
另外，跟体重匹配的对照小鼠相比，GTT实验显示PpargMyod1-KO鼠有出现葡萄糖不耐受现象。
综上说明，糖酵解米色脂肪对于阻断β-AR后寒冷诱导的小鼠的适应性产热及全身的葡萄糖稳态是必需的。
此图为原文Fig. 5。图a是18F-FDG PET/CT显示的Myod1-DTR+和对照组老鼠冷刺激后脂肪生成情况。绿色箭头指示小鼠腹股沟WAT摄入18F-FDG。图b是图a中老鼠相应组织摄入18F-FDG的定量。图c-d显示相应基因型老鼠腹股沟WAT的OCR和ECAR情况。图e是在相应的时间点加入葡萄糖和2-去氧葡萄糖（2-DG），检测老鼠腹股沟WAT的ECAR。图f是接受5天β-blocker预处理的Control鼠和PpargMyod1-KO鼠及未接受β-blocker预处理的WT鼠暴露于15℃时的核心体温，然后在指示的时间点给予急性β-blocker处理，再暴露于10℃时老鼠的核心体温变化。图g是腹腔注射GTT实验的结果。图h是糖酵解米色脂肪发育机制图。
学霸笔记
套路分析
直接看下面的文章大纲吧。值得注意的是，这篇文章中的老鼠一会儿暴露于寒冷中，一会儿处于室温，容易混淆。记住文章的主线是，阻断β-AR后让老鼠在室温待几天，使其产生MyoD+生肌细胞，然后将其暴露于寒冷中，MyoD+生肌细胞可转变为糖酵解能力增强的糖酵解米色脂肪细胞。
闪光点与不足
米色脂肪的生成一般是通过β-AR通路介导的，这篇文章的闪光之处在于，它发现敲除β-AR后，老鼠依然能够生成米色脂肪，而且是一种在发育起源、代谢能力方面都与传统的米色脂肪不同的新型米色脂肪。
不足之处是，阻断β-AR后，WAT的MyoD+细胞是如何形成的没有探究清楚。
启发与思考
这篇文章提示β-AR介导的经典米色脂肪生成通路可能还存在不依赖β-AR的补充通路，然而这个补充通路平时是否存在，除了阻断β-AR，还可以在什么条件下激活等问题都还值得我们进一步探索。
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