美文网首页生信精读文献医学最前沿
Nature| cGAS功能新发现:核内cGAS抑制DNA修复,

Nature| cGAS功能新发现:核内cGAS抑制DNA修复,

作者: 学霸带你读文献 | 来源:发表于2018-11-07 22:18 被阅读196次

    上周得知李咏去世的消息,大家很是震惊感叹,网上出现各种防癌指南,有人突然有些恐慌,赶紧去做各种体检,或调整饮食生活方式。

    你知道吗?我们每天暴露于各种各样的内外因素中,如紫外线、辐射、化疗药物、病毒感染等,DNA难免会遭受各种各样的损伤。据估计人类每个细胞每天要遭受约70000处损伤【1】,如果没有良好的修复机制,我们的细胞早就癌变了。不过不用担心,正常状态下体内的DNA修复机制足以处理这些损伤,但当DNA的修复机制出现问题时,就极有可能增加细胞的癌变倾向。

    据预计DNA修复功能受损时DNA的损伤和突变频率【1】。

    2018年10月24日同济大学医学院、同济大学附属肺科医院戈宝学教授与同济大学生命科学与技术学院、同济大学附属第一妇婴保健院毛志勇教授研究团队合作在在Nature杂志发表了题为Nuclear cGAS suppresses DNA repair and promotes tumorigenesis的研究成果,首次发现核内cGAS能够抑制DNA修复,促进肿瘤生成【2】,这一发现或许能为肿瘤的治疗提供新靶点。该研究结果同时被Nature Reviews Molecular Cell Biology杂志作为亮点研究报道【3】。

    下面我们一起来精读这篇文章,学习作者的套路吧。

    NOW现在行动!

    背景介绍

    我们知道,正常情况下,DNA只存在于细胞核和线粒体中,当DNA出现在细胞质中,则意味着出现了异常。

    环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP Synthase, cGAS)是2012年陈志坚课题组【4】鉴定到的一个酶,它能够感受到细胞质DNA的存在,并激活下游的炎症反应。胞质DNA与cGAS结合,诱发cGAS的催化中心发生构象改变,把GTP和ATP转化为环鸟腺苷酸(cyclic GMP-AMP, cGAMP)。cGAMP是接头蛋白STING(Stimulator of IFN Gene)的高亲和力配体,可以结合并激活STING,激活下游的I型干扰素和炎症因子。

    cGAS-cGAMP-STING信号通路的示意图【5】。

    方法与结果

    1 DNA损伤引起cGAS核转位增加

    为了验证DNA损伤条件下cGAS是否有变化,作者用依托泊苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)和过氧化氢(H2O2)三种基因毒性药物处理三种人成纤维细胞,均发现基因毒性药物引起的DNA损伤可使cGAS核转位增加。

    此图为原文Extended Data Fig. 1。NT表示未用基因毒性药物处理(untreated)。b-d 图分别为三种基因毒性药物处理HCA2-TERT细胞后cGAS的免疫荧光照片,可以看到与未处理组a 图相比,cGAS入核明显增加。e 图是a-d 图的定量。f-i 图与a-d 图类似,只不过免疫荧光检测的是HA标记的cGAS。α-laminA/C染色证明核膜的完整性。j-m 图是用两个捐赠者的皮肤成纤维细胞做相应的处理,n 图是相应的定量。o 图是细胞流式技术检测细胞凋亡,CCCP是阳性对照,与NT组比,基因毒性药物处理组细胞凋亡改变不显著。 此图为原文Fig. 1b。作者对依托泊苷处理的HCA2-TERT细胞的核、质分别进行WB,可见随着依托泊苷处理时间的延长,细胞核的cGAS逐渐累积。 此图为原文Extended Data Fig. 2。作者在A549和PC-9两种肺癌细胞株上进行实验,同样观察到基因损伤药物可导致cGAS核转位增加,而且呈时间和剂量依赖效应。

    2 cGAS核转位依赖于其Y215位点的磷酸化

    背景介绍中提到cGAS的经典功能是感知细胞质DNA,并进一步引发下游炎症反应,这一功能的发挥依赖于cGAS的DNA结合域和酶学功能域。

    那么DNA损伤引起的cGAS核转位增加是否也依赖于这两个功能域呢?

    作者定点突变这两个结构域,结果显示cGAS核转位的增加不依赖于cGAS的DNA结合域和酶学功能域,这意味着cGAS核转位的机制跟经典的cGAS-cGAMP-STING信号通路走的不是同一条路。

    此图为原文Extended Data Fig. 3。作者定点突变cGAS的DNA结合域和酶学活性域后再用依托泊苷处理细胞,观察cGAS的核转位变化,a 图为免疫荧光图片,b 图为相应定量图,其中第一列为WT对照,第2-3列为酶学活性域定点失活突变,第4-6列为DNA结合域定点突变,可以看到与WT相比,突变DNA结合域和酶学活性域未能显著影响cGAS的核转位。

    那么cGAS的核转运增加依赖于哪一个位点呢?

    cGAS第215位的酪氨酸(Y215)是个高度保守的位点,作者发现将该位点的酪氨酸突变后能明显抑制DNA损伤后cGAS的核转位,而且突变后酪氨酸的磷酸化水平明显降低。

    此图为原文Extended Data Fig. 4a-e。a 为保守性分析,黄色高亮为保守序列,红色高亮为绝对绝对保守序列。△标注的即是Y215位点。b-e 图显示Y215E突变后,用基因毒性药物处理PC-9细胞,cGAS核转位水平未明显增加。 此图为原文Fig. 1c-e。c-d 图为依托泊苷处理PC-9细胞4h后WT型和Y215E组cGAS核转运的变化,与Extended Data Fig. 4b-c 差不多。e 图显示Y215A突变后cGAS的磷酸化水平明显降低。 左图为原文Fig. 1f,右图为原文Extended Data Fig. 4g。这两幅图想说明Y215的磷酸化水平逐渐降低伴随着DNA损伤后cGAS的核转位增加,从而推测Y215的磷酸化参与调控cGAS的核转运。然而学霸看图只能得出随着Y215的磷酸化水平逐渐降低,细胞cGAS的水平逐渐增加,不知道是细胞核的cGAS增加还是细胞质的cGAS增加,β-actin应该是细胞质的内参。可能是学霸没太看懂。你看此图能得出作者的结论吗?欢迎你告诉学霸。

    3 BLK负责cGAS Y215位点的磷酸化

    既然作者怀疑Y215的磷酸化参与调控cGAS的核转运,那么就要找出控制Y215位点磷酸化的激酶。

    作者构建了靶向89个酪氨酸激酶的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)文库,观察其对cGAS核转运的影响,结果发现B淋巴酪氨酸激酶(B-lymphoid tyrosine kinase, BLK)的敲低能明显增加cGAS的转运,同时伴随cGAS磷酸化水平的降低。

    将cGAS Y215E位点突变后,再敲低BLK,用基因毒性药物处理,细胞的cGAS核转运水平与未敲低BLK组相比无明显变化。以上说明BLK通过维持cGAS Y215位点的磷酸化使cGAS定位于细胞质,而基因毒性药物促使cGAS Y215位点去磷酸化,从而便于cGAS向细胞核转运。

    此图为原文Fig. 1g-l。h-i 图显示敲低BLK后,基因毒性药物处理后的cGAS核转运明显增加。j 图显示敲低BLK后,随着依托泊苷处理PC-9细胞时间的延长,cGAS的磷酸化水平明显降低,未敲低BLK组p-cGAS也有随依托泊苷处理时间延长逐渐降低的趋势,但变化不及敲低BLK组显著。k-l 图显示cGAS发生Y215E定点突变后,敲低BLK,基因毒性药物处理后的cGAS核转运水平与未敲低组相比无明显变化。 此图为原文Extended Data Fig. 4h-j,是敲低BLK后用喜树碱处理PC-9细胞的结果,结论与上图一致。

    4 cGAS依赖NLS2序列与导入蛋白进行核转位

    cGAS包含2个核定位序列(nuclear localization sequences, NLS),提示cGAS的核转位可能是一个经典的依赖导入蛋白(importin)的过程。

    Co-IP证实cGAS与导入蛋白α家族的KPNA1~KPNA5存在相互作用。分别删除NLS1和NLS2序列,发现删除NLS2序列后能够解除cGAS与KPNA2之间的相互作用,且能够抑制DNA损伤引起的核转位,提示cGAS依靠NLS2序列与导入蛋白相互作用进行核转位

    此图为原文Extended Data Fig. 5。a 图展示cGAS的两个NLS序列,b 图显示NLS2序列的保守性。c 图为Co-IP。d 图显示删除NLS2序列后明显抑制cGAS与KPNA2的相互作用。e-j 图显示删除NLS2序列后明显抑制基因毒性药物引起的cGAS核转位。k-p 图是用导入蛋白β家族的抑制物Importazole处理细胞,能明显抑制基因毒性药物引起的cGAS核转位。

    5 γH2AX促进cGAS被招募到DNA损伤位点

    DNA损伤后会引起cGAS核转位,那么cGAS具体转位到细胞核中哪个位置呢?

    激光微辐射显示cGAS被招募到DNA损伤处,染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验进一步证明cGAS被招募到双链DNA损伤处(double-stranded breaks, DSBs)。

    H2AX(H2A histone family member X)是H2A家族的一种组蛋白,当DNA发生DSBs时,H2AX 的S139位点会发生磷酸化,转变为γH2AX,参与DNA损伤的修复,因此γH2AX是DSBs的一个很好的标志物。

    作者运用Co-IP发现cGAS与γH2AX存在相互作用,且DNA损伤能增强其相互作用。通过deletion analysis,作者证明cGAS通过其羧基端(氨基酸213-522)与γH2AX相互作用,而γH2AX的S139位点是cGAS与γH2AX相互作用不可缺少的。作者通过无标记生物分子相互作用技术(label-free biomolecular interaction assay)进一步证明S139位点的磷酸化cGAS与γH2AX相互作用的必要条件。

    免疫荧光显示cGAS与γH2AX共同定位于DNA损伤位点,而用shRNA敲低H2AX后能够抑制cGAS被招募到DNA损伤位点。

    以上说明γH2AX能够促进cGAS被招募到DNA损伤位点,并通过S139位点与cGAS直接发生相互作用

    此图为原文Fig. 2a-d。a 图是激光微辐射损伤U2OS细胞后,GFP标记的cGAS被招募到DNA损伤位点的动态图。b 图用I-Scel酶处理细胞造成DSBs,然后用ChIP证明I-Scel酶处理4h后,cGAS明显富集于DSBs处。c 图是不同浓度的cGAS 与γH2AX相互作用的动力学图。d 图显示cGAS与γH2AX共同定位于DNA损伤处。 此图为原文Extended Data Fig. 6。a 图是Co-IP证明依托泊苷处理后H2AX与cGAS和γH2AX存在相互作用,b 图用Co-IP证明依托泊苷处理后γH2AX与cGAS存在相互作用。c 图显示依托泊苷和H2O2处理后H2AX与cGAS和γH2AX的相互作用增强。d-e 图显示cGAS主要通过其213-522段氨基酸与cGAS相互作用。f图显示H2AX发生S139A突变后,其与cGAS的结合明显减弱。h 图显示cGAS与S139位点未磷酸化的H2AX相互作用的动力学图,可见基本没有结合,与原文的Fig. 2c 形成鲜明对比。i 图显示shRNA能明显敲低H2AX的表达。j-k 图显示敲低H2AX后能明显抑制cGAS在DNA损伤位点的聚积。

    6 cGAS抑制DNA损伤后的同源重组

    以上证明了DNA损伤后cGAS被招募入核定位到DNA损伤位点,那么cGAS被招募过去发挥什么作用呢?

    作者检测了DNA的两种DSBs修复通路的效率,即同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)修复,发现过表达cGAS可以显著抑制同源重组,对NHEJ则影响不大;降表达或敲除cGAS能明显增加同源重组,对NHEJ也无明显影响。

    因为过表达I-SceI造成的DSBs引起了细胞Ⅰ型IFN的表达轻度增加,考虑到经典的cGAS-cGAMP-STING信号通路,Ⅰ型IFN的增加会不会是由于cGAS引起的?cGAS对同源重组的抑制又会不会是通过Ⅰ型IFN发挥的作用呢?

    然而作者过表达cGAS发现其不会引起Ⅰ型IFN的表达增加,加入外源性的IFNβ或IFNβ nAb对同源重组和NHEJ也没有明显影响。这些结果提示cGAS抑制DNA的同源重组并不依赖于Ⅰ型IFN的产生。

    那么cGAS是如何抑制DNA的同源重组的呢?

    作者发现过表达cGAS对细胞周期分布和细胞增殖并无明显影响,但能够抑制两个关键的同源重组因子RPA2和RAD51被招募到DSBs,因此提示cGAS通过影响DNA的同源重组信号通路,而非使细胞周期停滞来影响DNA的同源重组的。

    那么cGAS序列的哪一部分参与抑制DNA的同源重组呢?

    作者将cGAS的DNA结合域和酶学功能域突变后,cGAS仍能抑制DNA的同源重组,提示这两个结构域非必需;作者诱导cGAS发生Y215E突变或△NLS2突变或用导入蛋白的抑制剂importazole处理后,能明显解除cGAS对同源重组的抑制,说明cGAS的核转位是抑制DNA同源重组的必要条件。此外敲低BLK能更明显地抑制同源重组,掩盖过cGAS对同源重组的抑制作用。

    以上证明BLK调控的cGAS核转位过程通过影响DNA的同源重组参与DNA损伤后的修复过程

    本图为原文Fig. 2e-p。e-f 图分别 显示过表达和敲低cGAS可影响HR,而对NHEJ无明显影响。g 图是rescue 实验,在敲除cGAS的细胞中转染cGAS,能明显抑制敲除cGAS引起的HR的增加。h-i 图显示加入IFNβ或IFNβ nAb不影响HR效率。j 图显示DNA辐射损伤后RAD51的动态变化,k 图为其相应的定量,可以看到过表达cGAS明显降低RAD51阳性细胞的数量。l 图为彗星实验,彗星尾巴越长,代表DNA越不稳定,可以看到过表达cGAS降低DNA的稳定性,m 图为其相应定量。n 图显示过表达cGAS组和Y215E突变组都有cGAS的表达,o 图显示Y215E突变能解除cGAS对HR的抑制,p 图显示敲低BLK明显抑制HR效率,且此效应超过过表达cGAS对HR的抑制作用。 a 图显示的是构建DNA双链损伤后HR和NHEJ修复的报告载体的方法。b-c 图显示的是在两位捐赠者的原代细胞中过表达cGAS能明显抑制HR,对NHEJ无明显影响。e 图显示在有或无I-Scel酶时转入cGAS对IFNβ转录的影响。g-l 图显示不同的基因损伤条件下(IR表示离子辐射),cGAS过表达组和对照组的RPA2位点的变化。m-n 图是彗星实验,显示敲除cGAS后基因组DNA的稳定性增强。o-q 图显示在鼠的成纤维细胞细胞中敲除cGAS后,DNA的稳定性增强。r 图显示过表达cGAS对细胞的周期分布无明显影响。s-t图显示的是EdU实验检测细胞增殖。 此图为原文Extended Data Fig. 8。a-g 图为mutation analysis。h图显示加入导入蛋白抑制剂Importazole可以抑制HR,足以掩盖住cGAS的抑制作用。

    7 cGAS通过抑制PARP1-Timeless复合物的形成抑制DNA同源重组

    通过免疫沉淀及蛋白质谱分析,作者发现DNA损伤后PARP1(poly ADP-ribose polymerase 1)与cGAS存在相互作用。PARP1是一种DNA修复酶,参与DNA的碱基切除修补和DSBs修补。

    作者进一步用Co-IP验证PARP1与cGAS确实存在相互作用,且加入DNaseⅠ后这种相互作用仍存在,说明其相互作用不是依赖DNA的。然而加入PARP1的抑制剂奥拉帕尼(olaparib)或将PARP1酶学失活突变(E988K)则能抑制PARP1与cGAS的相互作用。

    GST-pull down显示cGAS与PARP1并不存在直接相互作用,GST-pull down、Co-IP和无标记的生物分子相互作用实验显示cGAS与PAR(poly(ADP-ribose))之间存在直接相互作用。因此PARP1与cGAS的相互作用是通过PAR介导的。

    敲低PARP1可以抑制同源重组,并能减轻cGAS对同源重组的抑制。既往研究显示PARP1与Timeless相互作用通过促进同源重组参与DNA的修复,作者发现过表达cGAS能明显抑制DNA损伤后PARP1与Timeless的相互作用,但不影响PARP1被招募到DNA损伤位点。

    用奥拉帕尼抑制PARP1的酶学活性几乎能完全阻断DNA损伤后引起的cGAS核转位,提示DNA损伤激活PARP1是cGAS核转位的先决条件

    此图为原文Fig. 3。a 图通过Co-IP证明PARP1与cGAS存在相互作用。b 图为GST pull-down实验结果。c 图显示PAR与cGAS之间存在相互作用。d 图是用表面固定的PAR检测其与不同浓度的cGAS的相互作用,可以看到PAR与cGAS存在相互作用。f 图显示敲低PARP1能明显抑制HR。g 图显示cGAS后抑制PARP1与Timeless的相互作用。 此图为原文Extended Data Fig. 9。a 图为蛋白质谱结果,1和2是过表达cGAS组存在而对照组不存在的两个蛋白条带,b 图显示的是这两个条带代表的蛋白信息。c 图证明PARP1与cGAS存在相互作用,且加入DNase Ⅰ不影响其相互作用。d 图证明cGAS与PARP1存在相互作用,但PARP1的抑制剂Olaparib能减弱其相互作用。e 图显示PARP1的酶学失活突变抑制cGAS与PARP1的相互作用。f-h 图显示基因毒性损伤可引起PARP1与cGAS结合,过表达cGAS则抑制其结合。I-j图显示激光微辐射损伤后PARP1被招募到DNA损伤位点的情况。k-m图显示用Olaparib处理细胞后,再用基因毒性物质刺激,cGAS核转位无明显增加。

    8 核内cGAS促进肿瘤发生

    作者首先在体内动物模型中发现敲低Cgas可以明显抑制癌症细胞增殖速率和克隆形成,减小肿瘤大小,稳定基因组DNA。

    然后作者在临床非小细胞肺癌人群中发现cGAS的异常高表达,及调控cGAS的分子,如KPNA2和BLK的表达水平与非小细胞肺癌患者的预后相关,如KPNA2highBLKlow的患者预后较差。

    以上提示cGAS的核转位参与肿瘤的发生发展

    此图为原文Fig. 4。a 图显示shRNA有效敲低Cgas的表达。b 图显示敲低Cgas能明显降低鼠肺癌细胞的增殖速率。c 图显示敲低Cgas可抑制肿瘤集落的形成。d-e 图显示敲低Cgas可明显减小肿瘤的大小。f-g 图显示敲低Cgas可增强DNA的稳定性。h-i 图显示敲低Cgas后肿瘤的γH2AX阳性细胞数量减少,提示DNA损伤减少。 此图为原文Extended Data Fig. 10。a 图为MTT细胞增殖实验结果。b 图显示过表达cGAS可促进肿瘤集落形成。c-d 图分别显示cGAS降表达和过表达条件下细胞在各种基因毒性药物作用下的存活比例(此处学霸觉得似乎弄反了,应该降表达时细胞存活比例增加,过表达时细胞存活比例降低,是我理解错了吗?期待你的指正)。e-f 图显示过表达cGAS促进克隆集落形成。g-h 图显示过表达cGAS降低DNA的稳定性。I图是整篇文章所讲述的故事机制图。j-k 图分别是cGAS在不同时期的肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中的表达水平。l-m图显示LUAD和LUSC中BLK和KPNA2的表达水平与患者预后的关系。

    结论

    DNA损伤促进cGAS核转位,通过阻止PARP1与Timeless形成复合物,抑制DNA同源重组,促进肿瘤发生。

    学霸总结

    看完这篇文章,学霸觉得十分爽快,有种想要击节称赞之感。好的文章就是如此,通过不同的细胞、不同的方法,从临床人群到细胞、再到体内动物,通过正向证明、反向证明,最终证明他的结论,让你不得不信服。

    整篇文章讲述这样一个故事:正常情况下,BLK维持cGAS Y215位点的磷酸化,使cGAS定位于细胞质。DNA损伤条件下,cGAS的 Y215位点磷酸化水平降低,cGAS在NLS2序列和导入蛋白的作用下转位到细胞核DNA损伤处,通过PAR与PARP1相互作用,阻止PARP1与Timeless形成复合物,从而抑制DNA的同源重组,降低基因组稳定性,促进肿瘤发生。

    本文的套路如下图所示。

    希望本文能给你启发。


    参考文献

    [1] Tubbs A, Nussenzweig A. Endogenous DNA Damage as a Source of GenomicInstability in Cancer [J]. Cell, 2017, 168(4): 644-56.

    [2] Liu H, Zhang H, Wu X, et al. Nuclear cGASsuppresses DNA repair and promotes tumorigenesis [J]. Nature, 2018, 563(7729):131-6.

    [3] Otto G. Inhibition by nuclear cGAS [J]. Naturereviews Molecular cell biology, 2018,

    [4] Sun L, Wu J, Du F, et al. Cyclic GMP-AMP synthaseis a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway [J].Science (New York, NY), 2013, 339(6121): 786-91.

    [5] Li T, Chen ZJ. The cGAS-cGAMP-STING pathwayconnects DNA damage to inflammation, senescence, and cancer [J]. The Journal ofexperimental medicine, 2018, 215(5): 1287-99.

    相关文章

      网友评论

        本文标题:Nature| cGAS功能新发现:核内cGAS抑制DNA修复,

        本文链接:https://www.haomeiwen.com/subject/fgrbxqtx.html