美文网首页医学最前沿
Science| 科学家发现或能阻止帕金森病恶化的新靶点

Science| 科学家发现或能阻止帕金森病恶化的新靶点

作者: 学霸带你读文献 | 来源:发表于2018-11-15 12:59 被阅读8次

    帕金森病(parkinson’s disease, PD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)之后第二常见的一种神经退行性疾病,多见于中老年人,患者主要表现为震颤、行动迟缓、肌强直等运动症状和一系列非运动症状。其目前的治疗方案只能缓解患者的症状,并不能阻止PD的进展,而PD是一种进行性恶化的疾病,因此找到能阻止PD进展的治疗方案十分重要。

    2018年11月2日美国约翰霍普金斯大学医学院神经退行性疾病和干细胞研究中心Valina L. Dawson和Ted M. Dawson团队在Science杂志发表了题为Poly(ADP-ribose) drives pathologic α-synuclein neurodegeneration in Parkinson’s disease的研究论文,发现Poly(ADP-ribose)可以增强α-synuclein毒性,促进α-synuclein聚集,并参与病理性α-synuclein介导的细胞损伤,促进PD进展。这一发现或许能为阻止PD的进展提供治疗靶点[1]。Science杂志同时对此研究结果发表了评论文章[2]。

    有没有觉得哪个分子很眼熟?对了,Poly(ADP-ribose) 就是PAR,上一篇文章也有提到哦。

    现在咱们一起学习下这篇文章吧。

    背景介绍

    帕金森病和α-突触核蛋白

    帕金森病是一种进行性的神经退行性疾病,患者主要表现为静止性震颤、行动迟缓、肌强直和姿势步态障碍四大运动症状,有的还伴有焦虑、抑郁、睡眠障碍、自主神经功能障碍、认知障碍等非运动症状。

    帕金森病主要的病理改变是中脑黑质部多巴胺(dopamine, DA)能神经元减少,残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体,即路易小体(Lewy body)。纤维样的α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)是路易小体的主要成分。

    α-syn是在大脑中广泛表达的一种突触前蛋白,生理状态下呈可溶的蛋白单体形式,当其聚集成不溶的纤维样寡聚体,则具有致病性,可引起神经元细胞死亡。病理性的α-syn可以像朊病毒一样在细胞间传播,促进PD进展。

    然而是什么引起α-syn的病理性聚集呢?病理性聚集的α-syn又是如何引起细胞死亡的?这些都还不清楚。

    PAR与PARP1

    Poly(ADP-ribose) (PAR)是Poly(ADP-ribose) polymerase-1(PARP-1)以NAD+为底物合成的产物。细胞核PARP-1和PAR的主要功能是发现各种原因引起的DNA损伤,并启动相应的DNA修复机制。

    PARP-1依赖性细胞死亡

    PARP-1依赖性细胞死亡(Parthanatos)是一种由于PARP-1激活引起的程序性细胞坏死形式,Parthanatos是根据“par”(PARP-1的酶学产物)+ “thanatos”(希腊语的死亡之神)而命名。

    Parthanatos这种细胞死亡形式广泛存在于神经系统疾病、心脏病等疾病中。

    因为Parthanatos中PARP-1和PAR可引起细胞死亡,故作者拟探究PARP-1和PAR是否参与PD中病理性α-syn引起的DA神经元丢失

    方法与结果

    α-syn PFF的神经毒性依赖于PARP-1

    α-syn预制纤维(a-syn preformed fibrils, α-syn PFF)是一种体外重组的α-syn,能够像体内的α-syn一样聚集成纤维,并能像朊病毒一样在神经元细胞间传播,当其被注射进小鼠的脑内,其S129位点可发生磷酸化,形成p-α-syn(病理性α-syn的一个标志),因此是研究α-syn的一个良好模型。

    为了探究α-syn PFF能否激活PARP-1,作者用α-syn PFF处理鼠的原代皮质神经元细胞,WB检测PAR的变化,发现第3-7d PAR的表达逐渐增加直至最高峰,并维持增加状态直到第14d。

    此图为原文Fig. 1A。

    PI染色发现PAR的增加伴随着细胞死亡的增加。

    用三种PARP抑制剂(ABT-888, AG-014699, BMN 673)处理细胞,则发现可以阻止α-syn PFF诱导的细胞PARP激活和细胞死亡。

    此图为原文Fig. 1B-D。B图为Hoechst染色和PI染色观察细胞死亡。

    α-syn PFF处理细胞能够促进α-syn进行 S129位点的磷酸化形成p-α-syn,并促进水溶性α-syn形成不溶性α-syn,两者都是病理性α-syn的特征。而PARP抑制剂能够明显阻止这些效应。

    此图为原文Fig. S1F-I。

    敲低或敲除PARP-1亦能明显阻止α-syn PFF诱导的PARP激活和细胞凋亡。

    此图为原文Fig. 1E-H。 此图为原文Fig. S2A-B。

    敲除PARP-1能够阻止α-syn PFF诱导的α-syn的磷酸化及不溶性α-syn的形成。

    此图为原文Fig. S2C-F。

    用广谱的caspase抑制剂Z-VAD能部分减轻α-syn PFF的毒性,而坏死性凋亡抑制剂Nec-1和自噬抑制剂3-MA无法减轻α-syn PFF诱导的细胞死亡,PARP抑制剂ABT-888则能够阻止α-syn PFF诱导的细胞死亡,说明α-syn PFF诱导的细胞死亡主要依赖于PARP-1,即parthanatos,而不是通过激活细胞凋亡、坏死或自噬。

    此图为原文Fig. S2G-I。

    上述实验结果显示敲除PARP-1或药物抑制PARP-1能够减少p-α-syn的形成,这种减少会不会是因为细胞内吞的α-syn PFF减少呢?

    作者富集细胞内吞体,检测PARP-1敲除和药物抑制条件下内吞体内biotin标记的α-syn PFF含量,发现均与对照组无明显差异,说明PARP-1不影响细胞对α-syn PFF的摄入。

    此图为原文Fig. S3A-D。

    背景介绍中提到α-syn PFF能像朊病毒般在细胞间传播,促进PD进展,那它的这种细胞间传播的特性是否也依赖于PARP-1呢?

    作者进行了微流控室实验,首先通过微流体装置将α-syn PFF加入到chamber 1 (C1),第14d再检测chamber 2 (C2) 和chamber 3 (C3)中是否出现α-syn,即α-syn PFF是否有传播功能。

    结果显示WT神经元组第14d可在C2和C3中可检测到p-α-syn, 而PARP-1 KO组基本检测不到,说明α-syn PFF的传播功能也依赖于PARP-1。

    此图为原文Fig. S3E-G。F图为E图的高分辨率图像。


    α-syn PFF通过NO诱导的DNA损伤激活PARP-1

    第一部分已经证明α-syn PFF能够激活PARP-1,并通过PARP-1发挥其神经毒性作用,那么α-syn PFF是如何激活PARP-1的呢?

    作者发现用α-syn PFF处理神经元细胞或将其直接注射到小鼠脑内,可引起细胞的NO水平增加及DNA损伤增加。

    用NO合成酶抑制剂L-NAME处理神经元细胞或小鼠大脑,则可以抑制α-syn PFF诱导的NO合成、DNA损伤及PARP-1激活。

    此图为原文Fig. 2。SNpc为小鼠的黑质致密带,γH2AX为DNA损伤的标志物。

    此外NO合成酶抑制剂还可以抑制α-syn PFF诱导的细胞死亡。

    此图为原文Fig. S4E-G。

    以上说明α-syn PFF通过激活NO合成酶,引起DNA损伤,激活PARP-1,通过parthanatos引起细胞死亡。

    α-syn PFF通过PAR介导DA神经元丢失

    前面已经证明α-syn PFF通过parthanatos引起细胞死亡,那么这一通路会不会跟PD中DA神经元的丢失有关?

    向小鼠一侧的纹状体内注射α-syn PFF可激活PARP-1,增加PAR水平,而敲除PARP-1或用PARP-1抑制剂处理后,可阻止α-syn PFF诱导的PAR水平增加,减轻α-syn PFF的神经毒性。

    同时,注射α-syn PFF 6个月后,WT小鼠注射侧DA神经元减少约50%,而PARP-1敲除组和PARP-1抑制剂处理组小鼠的DA神经元无明显减少。

    此图为原文Fig. 3A-B。B图为酪氨酸羟化酶染色和Nissl染色显示单侧纹状体注射α-syn PFF 6个月后小鼠SNpc的DA神经元数量,对侧(Contralateral)作为对照。C图为B图的定量。

    酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)是DA合成的关键酶,作者发现用α-syn PFF处理WT小鼠后,TH和多巴胺转运子(DA transporter, DAT)水平均明显降低,而敲除或抑制PARP-1,可阻止该现象。

    此图为原文Fig. S5A-E。

    此外,α-syn PFF处理的WT小鼠纹状体DA和DA代谢产物含量明显减少,PARP-1 KO组和PARP-1抑制剂处理组无明显变化。

    此图为原文Fig. 3D。 此图为原文Fig. S5F-H。DOPAC、3-MT、HVA均为DA的代谢产物。

    向WT小鼠大脑注射α-syn PFF可引起小鼠爬杆试验(pole test)时间延长,握力试验(grip strength)力量降低,敲除PARP-1或PARP-1抑制剂处理则可缓解α-syn PFF引起的PD运动症状。

    此图为原文Fig. 3E-F。爬杆试验是检测小鼠肢体协调能力的一种行为学实验,测量小鼠从木杆顶端爬到底端所需的时间,时间越短,则说明肢体协调能力越好。

    PAR促进α-syn纤维化

    既往研究显示PAR能够导致固有无序蛋白液体分层,引起其聚集,那么PAR能否促进α-syn聚集呢?

    在加或不加PAR的条件下,作者观察α-syn单体孵育一段时间后聚合物的生成情况,发现不加PAR时,α-syn单体孵育72h才出现不同分子量的α-syn聚合物,而加了PAR,24h即出现不同分子量的α-syn聚合物。

    不同孵育温度或不同浓度的PAR可引起α-syn纤维化效率的不同(原文Fig. S7A-C)。

    此图为原文Fig. 4A。此图为在加5nM PAR或不加PAR 条件下,α-syn单体在37℃孵育相应的时间。

    荧光染料硫黄素T(thioflavin T fluorescence, ThT)可用于淀粉样纤维聚集过程的定性定量监测。通过ThT荧光监测可见PAR能明显促进α-syn聚集。

    透射电镜观察到不加PAR时,α-syn单体孵育72h才出现α-syn寡聚体纤维,而加了PAR,12h即可看到α-syn寡聚体的形成。

    此图为原文Fig. 4B-C。

    因为PAR是个高度带负电的分子,为排除PAR引起的α-syn聚集是由于蛋白间的电荷相互作用,作者研究了同样带负电的PolyA分子对α-syn聚集的影响,发现其并没有显著促进α-syn聚集。

    Overlay assay显示PAR与α-syn之间有相互作用,而ADP ribose(ADPr)单体与α-syn之间没有相互作用,也不影响α-syn的聚集。

    此图为原文Fig. S7D-F。D图是overlay assay,用于检测蛋白间的相互作用。

    PARP-1能够促使蛋白发生ADP核糖基化,那么它会使α-syn发生核糖基化吗?

    体外核糖基化实验(IVRA)显示不会。

    Overlay assay和Co-IP均显示α-syn与PAR之间存在相互作用,作者运用deletion analysis和Co-IP确认α-syn通过其氨基端与PAR作用。

    此图为原文Fig. S8,显示α-syn通过其氨基酸与PAR相互作用。

    为了探究内源性的PAR生成是否能促进α-syn聚集,作者用N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)处理过表达α-syn的原代鼠皮质神经元细胞,发现NMDA可激活PARP,引起α-syn聚集,而敲除PARP-1或用PARP-1抑制剂处理后,α-syn不再聚集。

    此图为原文Fig. 4D-E。

    在过表达α-syn的PARP-1 WT型和PARP-1 KO型细胞中外源给予PAR,均可rescue α-syn的聚集。

    在过表达WT型α-syn和α-syn A53T的神经母细胞瘤SH-SY5Y中,给予PARP激活剂MNNG可促进α-syn聚集,敲除PARP-1或给予PARP-1抑制剂后,α-syn聚集减少,外源补充PAR则可同样rescue PARP-1敲除或抑制引起的α-syn聚集减少。

    此图为原文Fig. S9,说明PAR促进α-syn纤维化。

    PAR增强α-syn PFF的体外毒性

    前面证明了PAR与α-syn PFF结合,那么这种结合会改变α-syn PFF的生物物理属性吗?

    作者用蛋白酶K(proteinase K)消化α-syn PFF处理的和PAR-α-syn PFF处理的细胞,发现PAR-α-syn PFF处理的细胞更能抵抗PK的消化,提示PAR-α-syn PFF可能折叠的更紧密。

    此图为原文Fig. 4F。

    第一部分已经证明了α-syn具有神经毒性,作者大致重复第一部分的实验,如PAR促进细胞死亡(原文Fig. S10)、促进p-α-syn生成、促进不溶性α-syn生成、促进α-syn的内吞和传播(原文Fig. S11),证明PAR能明显增强α-syn的体外毒性。

    此图为原文Fig. 4G-H,显示PAR-PFF促进p-α-syn生成和不溶性α-syn生成。

    PAR增强α-syn PFF的体内毒性

    为了探究PAR对α-syn PFF体内毒性的影响,作者将α-syn PFF或PAR–α-syn PFF注射到小鼠一侧的纹状体内,发现注射PAR–α-syn PFF组更早出现DA神经元的丢失,更早形成p-α-syn,且p-α-syn的水平明显高于注射α-syn PFF组。

    此外,与α-syn PFF相比,PAR–α-syn PFF明显促进DA及其代谢产物的丢失(原文Fig. S13),TH和DAT水平下降(原文Fig. S14),小鼠爬杆实验和握力实验表现变得更差。

    图为原文Fig. 5A-G。A图为注射侧TH染色和Nissl染色,B图为TH染色定量。C-D图显示PAR促进p-α-syn形成。E图显示注射侧纹状体DA的含量。

    PD患者脑脊液PAR水平增加

    作者检测两个独立队列的PD患者和对照者的脑脊液(CSF)的PAR水平,均发现PD患者CSF的PAR水平明显增加,且PAR的水平与疾病持续时间和Hoehn & Yahr分期呈正相关。

    此图为原文Fig. 6。A-D图显示的是队列1(80名PD vs 31名Control)的数据,E-H图显示的是队列2(21名PD vs 33名Control)的数据。Hoehn & Yahr分期是一个用来评价PD病情严重程度的分级表,分为0-5期,数字越大,代表病情越严重。

    此外,作者发现PD患者黒质(substantia nigra, SN)的PAR水平也明显增加,这一点与既往的研究结果一致。

    此图为原文Fig. S15。A图为ELISA检测PAR的梯度稀释曲线,显示该方法能够检测PAR的浓度范围为3pM~50nM。

    结论

    病理性α-syn通过激活NO合成酶,诱导DNA损伤,激活PARP-1,产生的PAR促进病理性α-syn的生成,通过parthanatos引起细胞死亡。敲除或降低PARP-1可抑制病理性α-syn的毒性。PAR可在体内和体外增强病理性α-syn的毒性,形成前馈循环。PD患者的脑脊液和黒质的PAR含量明显增加。以上提示PARP-1的激活参与PD的进展,因此抑制PARP-1的激活有望阻止PD中DA神经元的进行性丢失。

    此图为全文的故事图解。

    学霸总结

    本文套路如下图所示。

    希望本文能给你启发。


    参考文献

    [1] Kam TI, et al. Poly(ADP-ribose) drives pathologic alpha-synuclein neurodegeneration in Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414).

    [2] Brundin P, et al. Cancer enzyme affects Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414): 521-522.

    相关文章

      网友评论

        本文标题:Science| 科学家发现或能阻止帕金森病恶化的新靶点

        本文链接:https://www.haomeiwen.com/subject/zrqyfqtx.html