大家好，本周学霸将带你精读2018年11月15日德国马克斯普朗克代谢研究所的Jens C. Brüning教授团队在Cell杂志上发表的题为Food Perception Primes Hepatic ER Homeostasis via Melanocortin-Dependent Control of mTOR Activation的研究论文。此研究通过对空腹小鼠予以标准食物或只可望可闻不可吃的标准食物处理，发现仅仅看到或闻到食物即足以激活肝脏的一系列促消化反应。
背景介绍
内环境稳态
正常生理状态下，机体内环境不是固定不变的，而是处于动态平衡状态，机体内环境的各种成分和理化性质只在很小的范围内波动，这种状态叫做内环境稳态（homeostasis），如人的体温波动于37℃左右，血糖也维持在一定的范围内。
进食对内稳态造成威胁
食物虽然是生存所必需的，但进食也会对机体的内环境稳态造成威胁，如引起血糖升高、激活脂肪和蛋白质的合成等。
进食是一个高度协调的过程，仅仅看到、闻到食物即足以引发一系列的生理反应，如心率加快、唾液和消化酶分泌增加等，即消化的头期。这使全身为即将到来的食物做好准备，以便及时将营养物质移出循环系统，维持血糖的稳定。头期主要由自主神经系统控制，然而具体机制尚不清楚。
肝脏参与进食后的内稳态调控
餐后血液循环中升高的胰岛素和营养物质可通过mTOR激活肝脏，充满营养物质的肝脏可激活内质网应激反应。
IRE1（inositol-requiring enzyme 1）是内质网的一个稳态感受器，正常情况下其腔内部分被伴侣分子结合，使其维持无活性状态。当内质网累积大量未折叠或错误折叠的蛋白时，伴侣分子与IRE1分离，引起IRE1激活，IRE1发挥其核酸内切酶活性，对Xbp1（X-Box binding protein）进行非常规剪接，形成Xbp1(s)。Xbp1(s)可激活一系列伴侣分子基因的表达，并激活脂质合成关键酶，促进ER扩张。
CNS调控肝脏的代谢通路
除了营养物质和胰岛素信号对肝脏的直接刺激，中枢神经系统（central nervous system, CNS）对肝脏的消化功能也发挥调控作用。下丘脑的弓状核存在AgRP神经元和POMC神经元，能够感受机体能量变化，对肝脏、脂肪组织、胰腺等发放神经冲动调控能量的合成与代谢。既往多认为能量摄入引起激素水平增加，然后反馈给AgRP神经元和POMC神经元，然而，近来的研究显示在能量摄入之前，即仅看到或闻到食物时，AgRP神经元和POMC神经元便已被激活。
因此作者拟探究仅看到和闻到食物能否激活肝脏，使其为即将到来的食物做准备。
方法与结果
1 食物感知促进肝脏内质网应激基因表达
作者将野生型（wildtype, WT）小鼠禁食16h，然后予以普通标准食物（refed组）或可望可闻但不可吃的套有铁丝网的标准食物（caged food组）或继续禁食（fasted 组）相应的时间，观察小鼠血糖、胰岛素、瘦素、去甲肾上腺素的变化，并处死小鼠，进行肝脏转录组测序。
结果如下图所示，caged food组血糖水平在30min时轻微上升，随后便下降至空腹水平，而refed组血糖可维持高水平至4h；caged food组血胰岛素水平2h时轻微上升，而refed组胰岛素水平在进食10min便出现上升，可维持至2h；两组的瘦素水平均于2h时上升，但refed组上升更显著；两组的血清去甲肾上腺素水平均无明显变化。
此图为原文Figure S1A-C。A图展示标准食物（food pellets）、假食物（faked food）和套有铁丝网的标准食物（caged food）。B图第一张图显示给予标准食物或caged food相应的时间，老鼠的食物摄取量，第二至第四张图显示相应的血糖、胰岛素、瘦素变化。C图显示给予食物后前30min老鼠的胰岛素和去甲肾上腺素水平变化。
肝脏转录组测序显示，与fasted组相比，暴露于caged food 前2h的差异基因数量维持在23左右，4h后便下降至1，而refed组差异基因数量持续上升，从30min的180个上升至4h的639个。
作者接下来探究caged food组与refed组是否有共同的差异基因表达，并进行GO、KEGG和GSEA分析，发现两组的“Xbp1激活伴侣基因”和“内质网的蛋白合成”注释明显富集，qPCR和WB验证两组中的Xbp1(s)确实存在高表达。
此图为原文Figure 1。A图为实验设计图。B图对肝脏转录组测序结果进行PCA分析，可见refed组与fasted组明显分开，caged food组仅30-60min时能与fasted组分开。C图显示不同时间点两组的差异基因数量。D图显示不同时间点Xbp1激活的伴侣基因数量和内质网蛋白合成相关基因数量的具体变化。E图为qPCR验证相关的候选基因表达。F图和G图分别为qPCR和WB验证Xbp1(s)和Xbp1(u)的表达，可见caged food组在30-60min时出现Xbp1(s)表达，而refed组Xbp1(s)的表达维持至4h。
2 食物感知迅速激活肝脏mTOR信号通路
作者对caged food组和refed组进行磷酸蛋白组学分析，发现核糖体蛋白S6、TOR、Rho、Ras和AMPK相关通路基因在两组均富集，而葡萄糖转运、脂类合成等通路相关基因只在refed组上调。
作者结合肝脏转录组测序与磷酸蛋白组学测序结果进行2D分析，验证了核糖体蛋白S6上调，同时发现两组的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines, PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines, PE）生物合成相关基因和蛋白上调。
此图为原文Figure 2。A图显示实验方案。B图对肝脏的磷酸蛋白组学结果进行PCA分析，发现refed组与fasted组明显分开，而caged food组介于两组之间。C图为所有数据的限制性GO分析，横轴为p值，灰色的bar为Benjamini-Hochberg方法校正后的p值。D图为具有Akt底物基序的磷酸化位点分布。E图为30min时refed组和caged food组与fasted组log2ratio散点图。E图显示在两组中和仅在refed组富集的GO结果。F图是结合30min时的肝脏转录组结果和磷酸蛋白组学结果进行的聚类分析。
因为核糖体蛋白S6属于mTOR通路的下游，作者探究了进食早期mTOR通路的磷酸化水平，发现进食5min两组即出现pmTOR (Ser2448)、pAkt (Ser473)、pP70S6K (Thr389)的上调，refed组进食5min出现pS6 (Ser235/236)上调，但pS6 (Ser240/244)无明显变化。进食10min两组的Xbp1表达均无明显变化。
雷帕霉素是mTOR的抑制剂，作者用雷帕霉素处理refed组和caged food组小鼠，发现与空载体组相比，雷帕霉素不影响小鼠的血糖水平，但能阻断refed或caged food诱导的pP70S6K (Thr389)和pS6 (Ser235/236)的磷酸化及Xbp1(s)的生成。
此图为原文Figure 3。A图为进食或暴露于caged food 5min时相应的磷酸化位点表达情况，B图为进食或暴露于caged food 10min时相应的磷酸化位点表达情况。C图显示用雷帕霉素（RAPA）处理后再进食或暴露于caged food 30min时小鼠的pP70S6K (Thr389)和pS6 (Ser235/236)表达情况。D图前两幅图为RAPA处理后小鼠的pP70S6K (Thr389)和pS6 (Ser235/236)表达WB定量，后两幅图为Xbp1(s)和Xbp1(u)的qPCR定量。
3 食物感知促进肝脏PC和PE合成
因为mTOR通路和Xbp1的剪接都与肝脏的脂质代谢有关，作者又检测了肝脏的脂质组学，发现refed组和caged food组的PC、PE和甘油二酯的合成明显上升。
此图为原文Figure 4。A图为实验设计。B图显示该脂质组学能注释的脂质数量和描述能力。C图为每一种脂质类别包含的脂质数量。D图是对所有脂质结果进行PCA分析，可见refed组与fasted组明显分开，caged food组30min和60min能与fasted组分开，后便与fasted组聚集在一起。E组是只考虑PC进行PCA分析，F图同时考虑PC的支链长度和不饱和键数量进行PCA分析，G和H图分别是只考虑甘油二酯和PE进行PCA分析，E~H图说明PC、长链不饱和脂肪酸、甘油二酯、PE是引起聚类的主要原因。
接下来作者又探究了refed和caged food对内质网形态的影响，发现refed 和caged food可使内质网扩张。
此图为原文Figure S4。A图为示意图，黑色的为内质网。
4 食物感知依赖MC4R激活mTOR和Xbp1(s)
前面证明了食物感知能引起肝脏内质网的适应性变化，那这种变化是否与神经元调控有关呢？
在下丘脑弓状核中有两类调节能量代谢的神经元，一类是促进食欲的AgRP神经元，另一类是能够抑制食欲、促进能量消耗的POMC神经元。
作者利用GCaMP6s（一种以GFP为基础的钙离子指示剂，荧光强度与钙离子浓度成正比）检测了自由活动的老鼠，发现只有POMC神经元有GCaMP6s表达；然后观察refed和给予caged food或fake food后老鼠Pomc神经元的钙离子浓度变化，发现refed和caged food组Pomc神经元的钙离子浓度明显增加，fake组无明显变化。
Fos蛋白的表达同样是神经元被激活的一个标志，作者发现refed和caged food组Pomc神经元的Fos蛋白表达增加，fake组无明显变化，同时Pomc神经元Fos蛋白的表达与肝脏Xbp1(s)的表达成正相关。
此图为原文Figure 5。A图显示下丘脑弓状核只有Pomc神经元表达GCaMP6s（绿色）。B图显示refed或暴露于caged food或fake food后小鼠Pomc神经元钙离子浓度的变化，可见前30min内refed组和caged food组Pomc神经元钙离子内流明显增多，fake组无明显变化。C图显示小鼠Pomc神经元Fos蛋白的变化。D图显示refed组、caged组和fake组Pomc神经元Fos蛋白的变化和肝脏Xbp1(s)的变化，以及两者间的相关性。
接下来作者探究体内激活POMC神经元对肝脏mTOR通路和Xbp1剪接的影响。
作者构建POMC神经元特异性地表达光敏感通道-2（Channelrhodopsin-2, ChR2）的老鼠，对其进行30min的光刺激，然后分析小鼠肝脏S6磷酸化和Xbp1剪接的情况，发现与ChR2野生型相比，过表达ChR2的老鼠接受光刺激后，小鼠的S6磷酸化水平和Xbp1(s)的表达水平均增加。
POMC神经元可以分泌α促黑激素（α melanocyte-stimulating hormone, αMSH）调节食欲，那么POMC神经元激活后对肝脏的调控是不是通过αMSH介导的呢？
作者比较了敲除黑素皮质素受体4（melanocortin-4 receptor, MC4R）的小鼠和野生型小鼠，发现refed可使MC4RKO小鼠和WT小鼠的S6(Ser235/236)磷酸化水平和Xbp1(s)表达水平同样升高，caged food却只能诱导WT小鼠的S6(Ser235/236)磷酸化水平和Xbp1(s)表达增加，对MC4RKO小鼠的S6磷酸化水平和Xbp1(s)水平无明显影响，提示食物感知激活肝脏S6蛋白和Xbp1(s)的通路是依赖黑素皮质素的。
此图为原文Figure 6。A图显示表达ChR2的POMC神经元。B图显示光刺激30min后对照组和POMC神经元过表达ChR2组相关分子的表达变化情况。C图显示光刺激30min后两组Xbp1(s)和Xbp1(u)的mRNA定量，及P70S6K和S6磷酸化水平的WB定量。D图和E图分别显示Wt鼠和MC4RKO鼠refed或给予caged food 30min 后pS6和Xbp1的变化。
5 POMC神经元通过交感神经激活肝脏的mTOR和Xbp1(s)
接下来作者探究POMC神经元激活引起的肝脏mTOR激活和Xbp1(s)表达是不是由肝脏的交感神经传导的？
作者构建POMC神经元特异性表达hM3Dq的小鼠，然后予以叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）激活表达hM3Dq的POMC神经元，观察肝脏交感神经活性（sympathetic nerve activity, SNA）变化，发现CNO能很快增加hM3DqPOMC组的肝脏SNA，而对照组无明显变化。
肝脏交感神经末端可释放去甲肾上腺素（NE），能与肝细胞表面的α1和β2肾上腺能受体结合。向小鼠腹腔注射NA可增加肝脏Xbp1(s)的表达，而预先用α1受体阻断剂处理可阻断NA诱导的Xbp1(s)增加。
作者在小鼠肝脏特异性表达hM3Dq，然后予以CNO刺激，发现与对照组相比，CNO能明显增加hM3DqAlfp组pmTOR (Ser2448)、pP70S6K (Thr389)、pS6 (Ser235/236)和Xbp1(s)的表达水平。
作者进一步在体外Hepa1-6细胞中进行验证。
予NE处理Hepa1-6细胞，可明显增加pmTOR (Ser2448)、pP70S6K (Thr389)、pS6 (Ser235/236)和Xbp1(s)的表达，但如果予以RAPA预处理，此效应则消失，提示NE激活肝细胞依赖mTOR通路。
此图为原文Figure 7。A图为在POMC神经元过表达hM3Dq和对照小鼠中给予CNO和空载体，小鼠肝脏交感神经活性（SNA）的变化。B图显示小鼠空腹16h后腹腔注射NA或先注射NA的α1受体阻断剂再注射NA，qPCR检测小鼠肝脏Xbp1的表达变化。C图显示让肝脏过表达hM3Dq的小鼠和对照组老鼠空腹16h后给予CNO刺激30min，老鼠肝脏相关分子的变化。D图和E图是用10 μM NE处理Hepa1-6细胞不同的时间，相关分子的表达水平变化。F图和G图显示的是先用RAPA处理30min，再NE处理30min，Hepa1-6细胞相关分子的表达水平。
结论
看到或闻到食物可以激活下丘脑的POMC神经元，进而通过交感神经激活肝脏的mTOR和Xbp1(s)，促进肝脏磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成，使肝细胞内质网发生适应性变化，增强内质网合成和折叠蛋白的能力，为即将到来的食物做好准备。
全文的图解摘要。
学霸总结
本文设计比较巧妙，对禁食16h的小鼠予以标准食物或caged food，然后利用转录组学、磷酸蛋白组学和脂质组学检测refed和caged food对小鼠肝脏基因转录、蛋白磷酸化和脂质合成的影响，发现caged food与refed均能引起肝脏mTOR激活和Xbp1(s)表达。作者进一步探究引起此变化的上游机制，最终找出下丘脑弓状核POMC神经元通过交感神经调控肝脏的这根线。
对于此实验设计，学霸有一个疑问，文中fasted组只有一个时间点，给予标准食物或caged food不同时间处理的数据都只与fased这个点比较，我在想随着禁食时间的延长，小鼠的肝脏会不会本身也会发生一些变化，因此fasted是不是应该也像refed和caged food组一样设置不同的时间点，refed和caged food应该与相同时间点的fasted数据进行比较？或者至少检测一下fasted组相应的时间点，用数据告诉我fasted组不同时间点的特征是一样的。您觉得呢？
此外，学霸觉得本文的introduction部分写的不错，思路很清晰，就是内容稍微啰嗦了点。大家可以学习一下作者的写作方法，同时仔细琢磨作者实验设计的思路。
希望本文能给你启发。
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