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写在前面
从10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了！整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”和第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”之后，小编再接再厉，整理了第三讲“蛋白质谱的原理及使用”的听课笔记，分享给各位。

前面跟大家分享了质谱仪的原理、性能参数，以及串联质谱仪的工作方式，错过的小伙伴请戳：

听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（一）
听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（二）
听课笔记之蛋白质谱的原理及使用（三）

今天是第三讲听课笔记的最后一篇，小编要跟大家分享的是质谱仪、纳升液相色谱和液质联用系统的使用与维护，以及如何对质谱系统的运行状态进行评估。

授课老师
这次课程的授课老师是来自中国农业大学生物学院的李溱老师。李老师于1999年本科毕业于北京师范大学，2007年于美国德克萨斯州Texas A&M大学获得博士学位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究。于2011年加入中国农业大学生物学院，任副教授，在植物生理学与生物化学国家重点实验室及中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室工作，负责生物质谱实验室日常运行，对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务，并开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。李老师对各种质谱仪器的原理、特点及运行维护有着非常丰富的理论积累和实践经验，很有幸能邀请到他为我们介绍蛋白质谱的原理和操作。
（文中所有图片均来自李溱老师的讲义，并获得发表授权。）

本次课程的内容分三大部分：
质谱仪的原理、使用与维护
纳升型液相色谱仪的使用与维护
生物质谱运行状态的评估

质谱仪的使用与维护
之前我们讲到了质谱仪主要分为以下五个部分，那么我们就分别针对这些部分来讨论一下使用中可能遇到的问题。

质量分析器
包括mass analyzer和mass filter。对于质量分析器的使用和维护，主要有以下几个要点：

1、 对分辨率和质量准确性进行校正。
这个怎么做呢？最简单的办法就是，每天我们对数据采集中的背景信号进行评估。

比如我们发现，每天质谱图的背景噪音中445.12003处都有一个峰，这应该是空气中硅酮或者装修材料导致的。通过评估这个峰的宽度和质量准确度，我们就能知道质谱的质量轴不是发生了漂移。除此以外，还可以用质量校正液对质量准确性进行评估，这个根据质谱仪的现状，可以每天做，或者每周来做。

2、 评估灵敏度
最简单的办法是做一个标准品，看看它的信号强度有多强，通过这个来评估质谱仪的灵敏度。如果发现灵敏度变差了，我们就要考虑是否有污染，或者某个参数设置错误。

3、 检测质量隔离的准确性以及离子传输/碎裂效率的评估。
这对QE质谱仪来讲，可能是更加明显的问题。在质谱仪做二级的时候，我们是利用四级杆对母离子进行选择，如果质谱仪的设置参数有问题，它对母离子的选择就会发生偏差。比如我们想让它选择质荷比为300的离子，结果它选择出来的是298的离子，就会产生错误。

还有一个问题，质谱仪不能把所有质荷比为300的离子都选择进来，在传输过程中会产生一些损失。针对传输效率，我们需要通过一些实验来分析。最简单的办法还是做一个标准品，通过标准品来看二级谱图的质量与之前运行得比较好的数据相比，是不是变差了。如果变差则说明离子传输的效率可能下降了，就需要通过校正液等，对参数性能进行校正和评估。

比如QE，就有专门的校正和评估程序，来检测传输效率是不是发生了下降。如果下降了，就需要清洗离子源、四级杆，或者传输系统，恢复它的性能。

真空系统
1、 每天需要检查初级真空和高真空的读数
这个是非常重要的，最好每天检查两至三次。质谱仪中的大部分问题都是与真空系统有关的。

2、 每天检查泵油液面、颜色和温度。
为什么需要检查泵油呢？下图红圈标记的地方是QE机械泵的一个窗口，可以用来检查泵油的颜色和液面。窗口旁边有两条线，分别是液面上限和下限，停机状态的时候泵油会高一些，显示比上限的刻度多一点，启动起来以后液面会下降一些。

如果泵油太多，泵会“打嗝”，从废气管排出多余的泵油；泵油太低的话，散热会出现问题。所以需要保证泵油是在两个窗口线之间的。

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泵油的颜色是另外一个很关键的指标，它能体现出泵油受污染的程度。新的泵油，比如现在常用的GS495合成泵油，未使用前是黄色的，随着使用时间增长，它会慢慢变成褐色。其它质谱仪，可能会用到Inland19泵油，未使用前是完全无色透明的，随时使用时间的增长，它也会变成褐色。当泵油变成褐色以后，实际上是在告诉我们，它的使用寿命到期了，应该换掉了。换泵油的频率通常是半年一次。

泵油的温度也是重要的指标。泵在工作的时候，泵壳温度在70℃左右，如果泵的温度过低，表示泵的负荷不足，如果温度过高，则很可能泵的某个部位发生了严重的磨擦或者摩损。有一定经验以后，我们可以用手摸一摸泵壳，如果感觉有点烫手，那个温度就是对的，如果非常烫手，那可能泵已经过热运行了。

3、 每周开震气阀震气15-30min
这个工作也很重要。如果不震气，很可能会导致泵的早衰。为什么会出这个问题呢？我们先来看下图：左侧整体图中红色框起来的地方就是泵的入口，右边是它放大以后的照片。

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泵的入口对着的就是ESI的喷针，喷针会以200nL/min的速度往泵里面喷乙腈和水，这些乙腈和水被泵抽走之后，就会通过废气管进入到泵油中，乙腈可以与泵油混溶，导致泵油越来越稀，而水是不会与泵油混溶的，只会与泵油产生一种“水火不相融”的效果，使泵油乳化。这些很热的水会在泵里面流动，腐蚀铸铁的泵头，导致泵头的缝隙变大，但泵的工作效率下降。可见，定期震气是必须要做的重要工作。

那么震气是怎么操作的呢？机械泵上会有一个震气阀，震气阀的目的是将新鲜的空气从此处抽到泵里面去。空气进入泵以后，会将泵油中的水蒸气（或者说湿气）带走，通过废气管排出来。水分排出来以后，泵的腐蚀就会得到控制了。

另外，我们要知道，与泵油互融的乙腈是没办法除掉的，所以我们需要每半年换一次泵油，来减少乙腈对泵油的污染。

4、 定期检查漏油情况
泵漏油是经常发生的，尤其是使用超过五年以后，漏油基本上是必然的。这个油会漏到哪儿去呢？通常比较好的质谱仪，比如QE，会有一个接油的盘子。其实当我们看到盘子里有油的时候，油已经漏了很久了。所以我们应该经常趴下来看看油壳的底部是否有油渗出来，如果有，就应该及时维修，防止因为漏油过多，造成泵里缺油，导致泵运行的质量就会越来越差，最后机械泵就会被烧坏。

5、 注意机械泵和涡轮泵运行噪声的变化
这是一个很微妙的过程。我们知道，新买来的机械，运行的时候噪音非常小，运行起来很安静。随着仪器的老化，它的声音会逐渐变大。但如果运行过程中噪音突然变大，则表示泵出现了一些故障，这时就需要关注真空度或者其它一些参数，看看泵的性能是否发生了变化。

尤其是涡轮泵，运行时如果出现了一个非常尖的类似哨音的噪音，就说明涡轮泵出现了一些故障，需要密切监视涡轮泵运行的真空度或者其它参数。如果发现了故障，可以第一时间排除，而不要等整个泵都坏了再维修，那就很耗时间了。所以泵噪音的变化，是一种快速的信号，可以提醒我们注意监视泵的运行情况，尽早排除故障或进行维修。

6、 检查仪器运行日志（log）中记录的运行参数
QE质谱仪每15分钟会自动记录一次仪器的运行参数，这个记录我们可以每天或每周查看，如果发现里面的参数突然发生了大的波动或变化，则表明相关的设备可能发生了故障，特别是与涡轮泵有关的电压、温度或工作电流等。

另一个我们常见的问题就是真空度报警。各个质谱仪都有可能出现真空度过高或过低的问题。泵损坏了会直接导致真空度过高。另外，毛细管离子传输的入口受了损伤，变大了，或者说没有拧紧，导致漏气，也会导致真空度过高。反之，当毛细管被堵塞时，会导致真高度过低。（后面会举一个例子，一只蚊子把毛细管出口堵住了，拿走蚊子以后真空度恢复正常。）

离子源和离子传输系统
1、 喷针的清洗
喷针的洁净度对喷雾稳定性的影响是很大的。前面介绍过，喷针是非常细的，长度大概是3-5mm，针尖的内径和外径不到10μm。样品通过针尖喷出去的，因为这里有高压，而且毛细管会有300℃的高温，如果样品在针尖处残留，我们肉眼是看不到的，但会导致喷针形成不了连续的喷雾，而是会形成断断续续的喷雾，或者很小的液滴。如果出现这种情况，就表示喷针的针尖污染了。

如何清洗呢？通常是用甲醇，也可以用异丙醇与水的混合溶液冲洗针尖，如果还是没办法把污染物洗下来，就只能换一个喷针了。质谱仪通常用的是不锈钢的喷针，这种喷针非常软，清洗的时候一定要小心，否则容易把喷针碰歪，就不能再继续使用了。

下图是一个比较极端的例子，一只蚊子跑了进去，把离子源出口堵住了，还把针尖碰断了。

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2、 离子传输毛细管的清洗
传输毛细管其实就是从大气压到质谱仪真空状态的一个渐变。进入质谱仪的所有样品，离子、空气、溶剂分子，都要经过它，所以它很容易发生污染。另外，毛细管的洁净度又会影响粗真空，如果毛细管很脏，真空度就会下降，还会导致灵敏度的降低。

通常情况下，毛细管的温度是很高的，我们需要把它冷却以后，再拆掉清洗。

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上图红色圈出来的就是毛细管的位置。拆掉以后的毛细管如下图：

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毛细管开口处的直径通常不到1mm。将毛细管组装上去以后，如下图，红色和橙色圆圈分别标记了毛细管的入口，以及它穿过质谱仪的出口。离子通过毛细管，进入到S-Lens。

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3、S-Lens的清洗

S-Lens可以看作是离子源的一部分，功能是聚焦离子。它的结构是由13片不同的铁片组成，通过下面的横截面图，我们看到它的每个铁片上有一个圆圈，而且这13个圆圈的大小是不一样的，靠左侧的圈大一些，靠右侧的小一些，离子是从左边进来，往右走的过程。

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当离子进入S-Lens以后，空气中其它的污染物也容易一起带进来，开始经过的是大圈，通常不会堵在圈上，再往后圈变小，空气中的污染分子就容易打到这些小圈上，使S-Lens发生污染。所以需要定期清洗。比如下图中拆下来的这个铁片，中心的圈周围那一片灰色的东西，就是污染物堆积而形成的。

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清洗的方法是使用1% Liqui-nox超声清洗，这是一种非常好用的清洗液。S-Lens的清洁度对灵敏度的影响是很大的，尤其是在做小分子的时候，S-Lens的污染很可能会导致信号丢失。所以如果发现质谱没有信号出来，可以先清洗一下S-Lens看看。

气体系统、计算机及供电系统
1、 气体系统
质谱仪在碰撞池里是需要充高纯度的氮气或者氦气的，这部分由供气系统来完成。一般情况下，我们要求4个9（即气体的纯度大于等于99.99%）的高纯氮或者高纯氦，在保证纯度的前提下，还要保证有一定的压力。

2、 计算机
目前高分辨质谱仪产生的数据量是非常大的，一小时产生500M-1G的数据很常见，所以每天可能会产生20G数据，一个月就有600G，硬盘很容易装满。所以我们一定要注意定期备份和删除数据，保证有足够大的硬盘空间来存放我们的实验数据。

3、 供电和空调系统
液质联用系统需要一个稳定的电源。如果供电系统不稳定，会导致很多问题。比如，电源不稳定会引起零地电压不稳，导致液相色谱不能给质谱仪准确的开始信号，使得它们无法同步，最终导致液相色谱与质谱的通讯发生错误。
另外，实验室的温度、湿度和洁净度，对于保证质谱仪在一个稳定的环境中运行，也是非常重要的。

散热系统
最后，对质谱仪的散热系统也需要进行除尘处理。QE有一个通风口，用来往里抽空气，达到通风散热的效果。通风口也可能被空气污染物堵塞，导致散热效率下降，所以需要定期清洗。

纳升液相系统的使用与维护
上面介绍了质谱仪在使用中的注意事项，接下来我们学习一下纳升液相色谱的使用与维护。
流动相和洗针液
1、流动相：纳升液相色谱有一个很大的特点，就是它的流动相消耗量非常少。我们可以计算一下，它的流速是在0.2-0.3μL/min，所以一个小时只会消耗十几微升的流动相，一天的用量也不会超过0.3mL的量。而一个溶剂瓶通常能装30mL的溶液，算下来可以用100天。

但是我们却不可能真正用到100天。因为流动相里的一些成分会挥发，比如乙腈、甲酸，而且水相可能会被污染，这些都会导致流动相变质。因此，我们需要严格注意并定期更换流动相，来防止流动相的挥发和微生物的滋生。
我们见过一些比较极端的情况，把溶剂瓶里的流动相倒出来后，发现瓶身上会有一圈白道，这就是长时间不更换溶液，里面长了大量的微生物形成的，这些微生物的代谢物会严重污染样品，造成分析结果很不准确。

2、洗针液：在使用洗针液时，要确保样品不被弱洗液洗脱，使用的强洗液要能彻底清洗进样系统，防止残留和交叉污染。

进样瓶
进样瓶的材料很重要，要求对样品的吸附很弱，所以通常使用塑料瓶，它比玻璃瓶的吸附力更弱一些。而且应该选尖底的塑料瓶（比如像下图这样的），可以保证最后一点溶液也能被进样器吸走。尖底瓶可以将最后残留的溶液控制在4μL以内。

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另外就是对自动进样器的温度进行控制，通常控制在8℃左右。可能你会问，为什么不能控制在4℃呢？4℃的时候，空气中的水分会在进样器内部凝结，造成进样器结露，8℃就没有这个问题。

这里需要特别注意的是，做纳升液相色谱，通量是非常低的，往往一天只能出十几个样品，也就是说，虽然我们的自动进样器是96位的，甚至更多，可以容纳很多样品，但是并不等于自动进样器可以当成冰箱来使用。如果你的样品比较多，在前处理完成后，都应该放到冰箱里，而进样器里只放一天能做的样品数，比如十几个。没必要把更多的样品都放到自动进样器里，这样可以缓解进样器的负担，也能避免样品因为自动进样器发生了故障或者温度太高时产生降解。

系统压力
系统压力是非常重要的部分。我们先来看看下面的柱压曲线图：

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柱压曲线可以很直接地反映出液相色谱系统是否正常。有操作经验的小伙伴都知道，液相色谱系统很容易发生堵塞，检查到底是哪里堵了，为什么会堵，都是非常头痛的事。那么，如何来及时发现色谱可能会出现的堵塞或者故障呢？这时候我们就可以好好利用柱压曲线来分析了。

上图中上面那条是正常情况下的曲线，分为两段，第一段（最左侧有两次大的起伏那一段）叫traping。这段实际上就是保留样品打到Trap柱上，用高水相（99%的水）和比较高的流速（2-5μL/min）来冲洗，把样品中的盐和其它杂质除掉，于是形成的这么一段压力变化图。

然后我们用0.2μL/min的速度开始跑梯度，跑完梯度就产生后面那一段较长的曲线，我们会看到压力会呈现出逐渐升高，再快速降低，再升高的过程。

第一段traping区，产生了一小段平稳的峰，这表示样品的盐已经被除掉了。而像下面那条曲线中的traping阶段，峰型明显不如第一张图平稳，出现了压力升高的现象，这表明样品中可能会有杂质在trap过程中被流动相慢慢地带到柱子里，而且会留在柱子上，导致柱上局部地堵塞。这种情况下说明样品前处理是有一些问题的，样品处理得不是很干净。

如果像第二张图中显示的那样，在traping阶段出现了压力变高的现象，则很可能样品中的杂质进入到了分析柱中，把分析柱堵了。这种情况下，在做完实验后，可以用相对高浓度的乙腈彻底地冲洗色谱柱，把里面的杂质冲洗干净。

在第二段，压力应该是慢慢地升高，然后降低，再升高的。因为99%水相的时候，压力是比较高的，而乙腈混合物中当水的浓度为80%-90%的时候，压力会慢慢上升，之后，随着乙腈浓度的升高，压力会有下降的过程，最后再回到比较高的压力水平。如果整个柱压曲线符合以上的变化规律，则说明整个过程是没问题的。但如果样品压力突然大幅度降低，表示管路的接头可能发生了断裂，这个也是需要特别我们留意的信号。

色谱柱超压和漏液
色谱柱如果压力过大，就超压报警。那么超压产生的原因可能有哪些呢？

酶解以后没有离心，或者胶没有处理好，样品颗粒或胶颗粒进来以后，将色谱柱堵塞；
有杂质把进样六通阀损坏了，这些杂质可能会从六通阀里被冲出来，堵住柱子；
没有裁剪整齐的石英毛细管。

说到石英毛细管的裁剪，这绝对是个技术活。我们知道，做柱子的时候要用石英毛细管进行连接，而连接处是不能直接拧到色谱柱的接头处的，需要通过一个套管，先把毛细管切了，再用套管来接。切割毛细管的工具通常是陶瓷片，切的过程中很容易产生一些碎片。而且毛细管的内径只有100μm多，外径也只有360μm，这么细的管子，切的时候需要内管和外面包覆的聚合物层一起切，这种聚合物材料的包覆层也容易切出毛边。这些毛边和碎片，很容易进到色谱柱里，造成堵塞。

这个问题怎么解决呢？我们需要升级一下裁剪工具，比较建议大家使用下图的毛细管切割器。价格有点贵，3000多人民币，但切出来的口是非常整齐的，如果经常需要用的话，可以考虑买一个。用毛细管切割器可以很有效地解决毛边的问题。

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除了超压，另一个可能出现的问题就是漏液，这个我们该怎么检查呢？常用的办法是用pH试纸。因为我们使用的99%的水和0.1%的甲酸，是酸性溶液，我们用pH试纸把整个管路接口检查一遍，如果发现试纸变成红颜色，则说明有漏液。
还有一个需要我们注意的问题，就是纳升液相色谱的套管和接头。我们先来看一张实物图：

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通常，液相色谱仪的管路都是1/16’的管路（即管路内径是1/16’英寸，大约1.6mm），而石英毛细管的外径是360-380μm，显然它们是不兼容的，也就是说，我们如果直接将毛细管装到管路接头处，会留有很大的缝隙，所以需要套管才能把两者紧密地接上。在进行管路连接时，我们需要保证套管的前沿与毛细管的前沿是并齐的，且是没有缝隙的。一旦有缝隙，会形成一个叫“死体积”的空间，导致色谱峰的变化。

另外，纳升液相色谱中使用的三通接头是1/32’的管路（直径0.8mm），与1/16’的管路也不兼容，所以还需要换一个1/32’的套管，再往上连接。

液相色谱管路使用的接头分两种，一种是PEEK（聚醚醚酮）塑料接头，它能承受的最大压力是5600 psi，另一种是不锈钢接头，可以承受的最大压力为10000 psi，这两种接头承受的最大压力是不一样的。我们在设置液相色谱系统压力时，需要考虑的是承受压力最弱的那个环节。比如，当色谱系统的任何一个接头使用了PEEK材料，则整个系统的压力都不能超过5000 psi，否则当压力过大时，PEEK接头处的套管就很容易从接头处蹦开，导致漏液。我们在设置色谱的系统压力时，一定要确认清楚所有接头的类型。

液质联用系统的检查和保养
接下来我们来说说液质联用系统该如何检查和保养。
每日检查
1） 实验室温湿度：如果实验室温度过高，比较空调坏了，则应该马上停止实验，否则，质谱仪很容易因为温度过高而造成测量结果不准。比如Q-TOF，过热了以后，它的TOF管长度就会发生变化，质谱质量轴就会飘掉，导致结果很不准确。

2） 机械泵油面、工作温度和油壳渗漏

3） 系统真空度（粗真空和高真空）

4） 质谱质量轴：检查我们常看的值是否发生变化，如果有变化，说明质量轴已经不准确了，应该立刻停下实验重新校正。

5）溶剂瓶沉淀检查：晃动并观察溶剂瓶下部是否有絮状沉淀，如果有则说明流动相在溶剂瓶里至少存放了一周以上，应该立刻换掉，甚至应该把溶剂瓶的滤头也换掉，因为滤头里可能会有很多的微生物，而导致样品的交叉污染。

每周保养
1） 质量轴校正：校正的频率根据质谱仪的不同而不同，例如QTOF，校正的频率可能需要更高一些，具体的频率要参考仪器商提供的手册说明。

2） 机械泵震气

3） 离子传输毛细管清洗

4） 流动相，洗针液更换

每月保养
1） 离子传输系统（S-Lens）的清洗

2） 离子传输性能评估和校正

3） 四级杆污染程度评估
半年保养
1） 更换机械泵泵油

2） 清洗四级杆

3） 色谱仪管路清洗：推荐一种“神仙水”，冲洗所有的管路，每次用量为20-50mL。它的配方是：水：甲醇：乙腈：乙醇 = 1：1：1：1

4） 色谱泵柱塞杆，密封垫渗漏测试：测试泵是否可以承受标称的压力，例如标称为10000 psi，那我们可以验证一下是否能做到。再比如，假设我们的方法设定是5000 psi，那我们跑一下试试是否会漏液，如果发现漏液，则说明该泵不能提供5000 psi的稳定压力，在此压力上由于它会漏夜，则流动相的流速测定也是错误的了。

5） 仪器除尘

6） UPS放电

7） 空调系统检修

如何评估质谱的运行状态
TIC图的峰强和峰宽
质谱系统的运行状态我们可以通过TIC图来判断。那么，什么是TIC图？TIC（Total Ion Chromatography）就是总离子色谱图。经色谱分离流出的组分不断进入质谱，质谱连续扫描进行数据采集，每一次扫描得到一张质谱图，每一张质谱图都对应唯一的一个时间点，将每一张质谱图中所有离子强度相加，得到一个总的离子流强度值，然后以离子强度为纵坐标，时间为横坐标，把各个时间点上的总离子流强度绘制出来，就形成了TIC图。

TIC图长什么样子？大伙儿来感受一下：

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为了评估质谱运行状态，李溱老师实验室通常是做一个BSA（牛血清白蛋白）的标准品，进样50-100 fmol（对应几纳克的BSA）。拿到TIC图以后，我们可以先来看色谱峰的强度，峰强度与灵敏度有关。完全清洗并安装好的质谱仪，峰的强度可以达到1E8-1E9，如果我们做完后发现强度只有1E7，则说明质谱的灵敏度有问题（这里需要先排除样品的质量有问题）。如果灵敏度是对的，则说明最基本的参数是没问题的。

对应上面的图，很明显可以看到，同样是自制的trap柱，系统彻底清洗后的峰强度，要大于运行一段时间后的值。

接下来看色谱峰的宽度，峰宽度决定了色谱柱的性能。如果发现峰变得异常的宽，比如下面这样的图，则说明色谱柱，尤其是trap柱的性能明显下降，这时候就需要更换trap柱了。

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我们回到第一张TIC图，观察一下会发现，大部分情况下色谱图里都会有一个污染峰（红色圆圈标记）。它是怎么来的呢？这就是我们用的EP管、枪头等带来的污染（就是传说中的塑料峰）。第一个图，由于彻底清洗了系统，所以污染峰是比较弱的，当运行了一段时间后会发现，污染峰又变高了，表示样品中的污染在Trap柱中慢慢地积累。这时候可以用90%乙腈的冲洗液来把柱里的污染物洗掉。

然后，我们再比较一下自制trap柱与商业trap柱的峰宽。第一个图的峰宽，通常在0.5-1分钟，当换成商业化的高端Trap柱（1.7μm粒径填料）时，它的峰宽明显要小很多，可以把峰宽控制在10秒左右。（这两组对比实验我们用的是用的是同一根分析柱。）可见，Trap柱的表现对色谱的性能有很大的影响，当使用比较好的Trap柱时，可以把峰宽控制得很窄。

另外我们需要评估的就是搜库的结果，结果的评分以及每条肽段被检测到的次数，可以反映出二级离子的碎裂效率。如果搜库得到的肽段得分都比较低，则说明二级离子的碎裂效率变差，这时需要考虑清洗色谱柱以及离子源设备等。

特别提示：导致色谱峰变宽的另一种可能，是trap柱严重污染引起的。这种情况下，我们会发现一个很神奇的现象，就是搜库结果的评分并不低，有时候反倒会非常高！这是为什么呢？

我们可以来分析一下。色谱峰变宽，代表着出峰时间变长。比如，原来在10秒-30秒可以出峰完的一个肽段，这时候可能需要2-3分钟来出峰。也就是说，该肽段被检测到的次数会增加好几倍，于是搜库软件也会打出的得分也会变高。而这时候得分变高显然并不代表柱效变高了，反倒是柱效下降了。这是一个很有意思的现象。它提醒我们，当察看搜库结果的评分时，一定要综合地判断，如果出现色谱峰变宽，即便评分很高，也不代表是一个好的结果。

异常峰
有时候，我们还会碰到TIC图出现一些很奇怪的峰。在展示不正常的峰之前，我们先来感受两张正常TIC图的画风。

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上面两张TIC图分别对应的是一个复杂样品和一个SDS-PAGE条带的简单样品。复杂样品中，我们可以检测到1000多个蛋白，SDS-PAGE条带对应着几十个蛋白。不同复杂度的样品，谱图的画风也是不一样的，通过谱图，我们对质谱仪工作的状态可以有一个了解。通常针对上千个蛋白，或者几十种蛋白，我们能看到的正常的谱图就是这样。

但有时候，我们会碰到一些很奇怪的TIC图，则可以判断色谱或质谱出了问题。比如下面的例子：

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可以看到，第一张TIC图在中间偏右的位置，有一系列连续的有规律的出峰，这种说明样品可能受到了PDMS或PEG聚合物的污染。它的特点就是，在质谱图上可以看到有一系列质量相差44、88或者74的污染峰。它们的来源通常是质量比较差的EP管。比如PDMS就是EP管的脱模剂，在制造的时候会涂在模具上，生产好后如果没有清洗干净，就会随着EP管进入样品。如果看到这样的峰，我们就得检查是不是EP管质量不好，下次应该更换质量更好的EP管。

第二张图是一个比较极端的例子，样品可能受到除PEG或PDMS以外的物质的污染，产生了非常强的污染信号，这种污染对于质谱来说是灾难性的，因为它的含量非常高，该信号强度相当于几微克蛋白对应的质谱信号。而且对于纳升液相色谱，所有的样品都是通过喷针进入到毛细管和质谱仪中的，也就是说，大量的污染也都进入到了毛细管和质谱仪中了，这是非常麻烦的事情，需要停机，做彻底地清洗。所以我们一定要使用质量好的EP管以及来源可靠的试剂。

超载
目前的质谱仪，性能已经非常好了，通常我们进样500ng就可以获得很好的鉴定结果，因此不需要盲目地大量地进样，否则就会造成超载的问题。

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比如上面第一张图，是正常的进样量，峰宽40秒左右，下面一张图则是盲目进样导致峰非常宽，超过了5分钟。

大量进样到底会造成什么样的问题呢？最直接的影响就是，容易污染离子源，而且在trap柱中不容易被彻底清洗干净，发生拖尾。也就是说，上一样品在trap柱中的残留会污染下一个进样。要解决这个问题，我们又得把整个实验停下来，非常彻底地清洗trap柱，耽误大量的时间。所以对于现在高性能的质谱仪来说，大家尤其不要盲目地增加进样量，这不但不能提高蛋白的鉴定效率，反而只会增加后续清洗的负担。

质谱信号丢失或不稳定
最后，我们来聊一聊当质谱没有信号了，或者信号不稳定的时候，应该怎么办。通常，查找问题的顺序和逻辑是这样的：

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首先我们要看有没有背景信号，就是说会不会得到一个基线噪音。如果没有基线噪音，有可能质谱仪系统，读不出任何数据了。下一步我们需要确认，当没有基线噪音时，有没有东西进入质谱仪，或者有没有东西从质谱仪出来：

1） 确认离子源有没有喷雾电压，如果没有喷雾电压，则说明喷雾停止了，没有东西进入质谱仪。如果有的话，比如喷雾电压设为2.0，而质谱检测到的电压为1.96，且还检测到了电流，说明离子源还在工作，有离子进入质谱仪。

2） 当确认了离子源还在正常工作以后，接下来要排除的是质谱仪数据传输故障，也就是说，质谱仪还在工作，能检测到数据，只是无法传输出来。这时可以检测一下质谱仪背后的连接线是否正常连接，有没有出现断开的情况。

3） 如果离子源和数据传输都正常，则很可能是质谱仪本身发生了故障。

4） 最后需要排除的可能是色谱柱发生了堵塞，或者色谱停泵了，导致液相色谱不再传送样品进质谱。这种时候，即便有喷雾电压，也有可能是质谱仪受空气中的污染而产生的电流。

以上就是没有背景信号的情况下最可能发生故障的地方，我们可以一一排查。

如果有基线噪音，却没有样品的信号，则需要排除以下可能：
1） 放错样品瓶。放进色谱的样品瓶里其实没有样品，或者样品装得太少了，进样针够不着样品。

2） Trap柱失效了。Trap柱是用来Trap蛋白的，正常的操作流程是，先用99%的水把蛋白样品打到Trap柱上去，然后再切换到分析柱上，把蛋白样品从Trap柱上洗下来。如果Trap柱失效了，它不能够Trap蛋白，蛋白样品就会被直接洗到废液中去，这样也会导致没有质谱信号。这种情况下我们需要更换Trap柱试试。

3） Trap柱切换阀的故障。这个切换阀决定了流出来的东西是进分析柱还是进废液，如果阀出现了故障，造成样品进不了分析柱，而是一直都只能进入废液，于是也就没有样品可以进入质谱了。

4） 漏液。如果发生漏液，则进质谱的信号会变弱，这种时候应该检测漏液情况。

如果有信号，但信号不稳定：
1） 系统漏液，导致流速变低，使得信号不稳定。

2） 喷针污染，没法喷出连续的气雾，断断续续的，且会在针尖形成液滴。这种时候质谱信号就会很不稳定。我们可以用甲醇或乙醇溶液把喷针冲洗干净再试试，如果还是解决不了，就需要换个新的喷针；

3） 往喷针上供电的接头插得不牢固，也会导致喷雾不连续。这时可以检查一下接头上是否锈掉了，如果有，把锈磨掉，再插上试试。

第三讲“蛋白质谱的原理及使用”听课笔记小编就全部分享完了，非常感谢李溱老师精彩的授课，以及对听课笔记细致的审阅修改！不知道读完整篇的童鞋们，是否有所收获呢？欢迎给我们留言，讲讲你的学习体会、问题或者建议！

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