题外音：speedseq是一套流程，套用了大量三方软件，但是居然也能发到Nature Methods上！惊讶之余查看了一下代码，非常佩服，简直是教科书一样的模式，太赞了！
1. speedseq的安装
1.1 安装前先需安装好python （建议升级到2.7最新版2.7.13），而且需要安装pysam库(需升级到最新版，这里升级到0.11.2版本)，如果没有升级，可能在speedseq sv方法中报如下错：
1.2 再安装root，只有安装了它cnvnator才可以正常安装。
从官网〔1〕下载root，有Binary distributions但是需要注意下载对应系统的版本（例如我这里下载的Ubuntu 14版本的）。
wget https://root.cern.ch/download/root_v6.10.08.Linux-ubuntu14-x86_64-gcc4.8.tar.gz
tar -zxvf root_v6.10.08.Linux-ubuntu14-x86_64-gcc4.8.tar.gz
# 解压为文件夹root
再修改\$HOME/.bashrc，添加以下两行
export PATH=/Path/to/rootdir/bin:$PATHexport LD_LIBRARY_PATH=/Path/to/rootdir/lib:$LD_LIBRARY_PATH
注意：/Path/to/rootdir即上一步安装root包时压缩后root文件夹的位置，请用绝对路径！
如果后期运行cnvnator时报错如下，则表明此处LD_LIBRARY_PATH设置有误。
error while loading shared libraries: libCore.so: cannot open sh
〔出现这种报错，可查看http://blog.sciencenet.cn/blog-653020-626976.html〕
再运行以下代码
cd root. bin/thisroot.sh
以上安装过程参考[2]
再按照官网[3]上的步骤下载安装speedseq
git clone --recursive https://github.com/hall-lab/speedseq
cd speedseq
make
# 经测试gcc 4.4.7版安装会有报错，gcc 4.8.5可正常安装
1.3 如果想用VEP做注释，还需先手动安装
正确安装方法如下：
curl -OL https://github.com/Ensembl/ensembl-tools/archive/release/76.zip
SPEEDSEQ_DIR=$PWD
# 注意：这里是speedseq安装目录（也是我的当前目录），以下操作我都在speedseq目录下完成！
unzip 76.zip
注意：因为bioperl下载地址改变，按照speedseq官网上安装会报错！一定要修改INSTALL.pl再运行。
vim ensembl-tools-release-76/scripts/variant_effect_predictor/INSTALL.pl
将第61行的BIOPERL_URL修改为以下地址，INSTALL.pl中的地址已失效，
http://www.cpan.org/authors/id/C/CJ/CJFIELDS/BioPerl-1.6.924.tar.gz
截图如下：
如果你研究的是人，可以用以下代码在本地建立人的数据库
perl ensembl-tools-release-76/scripts/variant_effect_predictor/INSTALL.pl \
-c $SPEEDSEQ_DIR/annotations/vep_cache \
-a ac -s homo_sapiens -y GRCh38
# 它会自动下载人的全基因组序列，具体地址如下：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-76/variation/VEP/homo_sapiens_vep_76_GRCh38.tar.gz，大小约3.1G
cp ensembl-tools-release-76/scripts/variant_effect_predictor/variant_effect_predictor.pl $SPEEDSEQ_DIR/bin
cp -r Bio $SPEEDSEQ_DIR/bin
speedseq非常赞的原因之一是它几乎集成了所有需要的三方软件（注：其中有些比较难安装），而且在/Path/to/speedseq/bin/目录下有个speedseq.config，其中记录了所有三方软件可执行程序的路径。这样就可以完全独立了（比方你系统环境变量中有多个samtools，或者多个python，你想用哪一个，就可以直接在这里指定）
安装完后进行测试，查看是否安装完整，建议将speedseq.config中每一行都测一下，看路径中的程序是否能正常运行。
我的/Path/to/speedseq/bin/下的程序如下：
2. speedseq的使用
像所有的好软件一样，speedseq也提供了example，在/Path/to/speedseq/example/目录下，该目录下有一个data目录（注意：data目录中的reference是bwa index过的）。
建议按/Path/to/speedseq/bin/run_speedseq.sh中代码一句句运行
2.1 speedseq align
注意：speedseq调用bwa-mem后，还生成了discordants.bam和splitters.bam，这两个文件是lumpyexpress必须的（这个已整合在speedseq中），那么这两个bam是怎么来的？
按照lumpy github官网[4]上的描述
speedseq align -R "@RG\tID:id\tSM:sample\tLB:lib" \
human_g1k_v37.fasta \
sample.1.fq \
sample.2.fq
注意：使用speedseq align时建议加上-o选项，它指定输出文件（夹）前缀；-t选项，它指定线程数（默认单线程）
以上等价于
# Align the data
bwa mem -R "@RG\tID:id\tSM:sample\tLB:lib" human_g1k_v37.fasta sample.1.fq sample.2.fq | samblaster --excludeDups --addMateTags --maxSplitCount 2 --minNonOverlap 20 | samtools view -S -b - > sample.bam
# Extract the discordant paired-end alignments.
samtools view -b -F 1294 sample.bam > sample.discordants.unsorted.bam
# Extract the split-read alignments
samtools view -h sample.bam \
| scripts/extractSplitReads_BwaMem -i stdin \
| samtools view -Sb - \
> sample.splitters.unsorted.bam
# Sort both alignments
samtools sort sample.discordants.unsorted.bam sample.discordants
samtools sort sample.splitters.unsorted.bam sample.splitters
2.2 speedseq var
这里调用的是freebayes，它的精确度与GATK不相伯仲，具体可能查看speedseq的引文[5]。
speedseq var除例子中的-o选项(指定输出文件前缀)外，还有以下几个选项值得注意：
-q 指定最低变异质量值（质量值小于这个值的将认为是不可信结果）
-A 使用VEP对变异检测结果进行注释，当然前提是安装好了vep，speedseq/bin中variant_effect_predictor.pl可用
2.3 speedseq的sv方法
建议加上以下选项
-g表示使用svtyper对SV breakends进行分型
-d表示使用CNVnator来计算read深度
-P 在vcf中输出LUMPY的概率曲线
参考材料
[1] https://root.cern.ch/content/release-61008
[2] http://www.cpp.edu/~pbsiegel/phy499/rootinstall.html
[3] https://github.com/hall-lab/speedseq
[4] https://github.com/arq5x/lumpy-sv
[5] chiang C., Layer RM., Faust GG, et al. SpeedSeq: ultra-fast personal genome analysis and interpretation.Nature Methods. 2015 Oct;12(10):966-968
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