细胞治疗采用生物工程的方法获取具有特定功能的细胞并通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞等功能，从而达到治疗某种疾病的目的。目前主要的细胞治疗方式为免疫细胞治疗和干细胞治疗，经过一段时间的发展，CAR-T细胞疗法已成为免疫细胞治疗中的热点。CyTOF技术作为最前沿的单细胞蛋白检测技术在CAR-T细胞治疗中具有不可替代的关键性作用，接下来分享三篇近期CAR-T细胞治疗中应用CyTOF技术取得的重要成果。
细胞治疗过程示意图
短暂休息逆转 CAR-T 细胞耗竭（IF=47.73）
因抗原的过度刺激或 CAR-T 细胞自发信号而导致 CAR-T 细胞耗竭是影响 CAR-T 疗效的一个原因。由美国斯坦福大学医学院Crystal L. Mackall教授团队构建一个可以人为操控“开”和“关”的 CAR-T 细胞，将 CAR-T 结合去稳定结构域（DD），以此调控 CAR 的表达。DD 在没有配体的情况下快速降解 CAR 的表达，而在加入配体后，稳定的 DD 会稳定表达 CAR，恢复 CAR 的信号。
透过 DD. CAR 的系统，研究人员探究短暂“关闭”CAR 信号可否增强 CAR-T 细胞的功能。在移植白血病细胞及 DD. CAR 细胞的 NSG 小鼠中，短暂阻断 CAR 信号(ON/FF)组相较于持续开启的 CAR-T (ON/ON) 及一直处于“关闭”状态的 CAR-T 细胞组 (OFF/OFF)，具有更好抑制肿瘤生长的效果。随后研究人员通过 CyTOF 技术进一步发现短暂阻断 CAR 信号除了可以逆转 CAR-T 细胞耗竭，还可以增加记忆型 CAR-T。结果显示耗竭的 CAR-T 细胞在短暂阻断其 CAR 信号 4 天后，不仅可以逆转其耗竭表型，还可以诱导转录重编程和整体表观遗传重构，达到和未耗竭的 CAR-T 对照组相似的水平[1]。
暂停CAR信号逆转CAR-T细胞的命运
CAR-T 细胞与白血病的抗癌反应和长期缓解相关的特征（IF=49.97）
重编程以靶向肿瘤细胞的 T 淋巴细胞的过继转移已证明具有治疗各种癌症的潜力，CAR-T 细胞在 ALL 和 CLL 中的功能持久性是持久临床反应的关键特征。然而，人们对注入细胞的长期潜力和克隆稳定性知之甚少。
近期，宾夕法尼亚大学、费城儿童医院、诺华生物医学研究所等团队的研究人员在顶级学术期刊《Nature》上发表了在 2010 年实现完全缓解的两名 CLL 患者的长效 CD19 重定向CAR-T 细胞的分析结果，解释了CAR-T 细胞疗法记录到目前为止对 CLL 的最长持续时间，并显示 CAR-T 细胞在输注到患者体内后至少十年仍可检测到。研究人员利用 CyTOF 通过 40 个蛋白 marker 对两名患者不同时间段的 CAR-T 细胞进行分析，发现患者的 CAR-T 细胞治疗反应有两个主要阶段：以 CD8+ T 细胞和 CD4-CD8- Helioshi CAR-T细胞为代表的初始反应阶段；以及由 CD4+ CAR-T 细胞占主导优势的长期缓解阶段，这些细胞继续表现出肿瘤细胞杀伤特性和持续的增殖。研究发现其中一个患者在 9.3 年检测到的 CAR-T 细胞仅为 CD4+，这表明 CD4+ T细胞可能是对 CD19 表达细胞的细胞毒性的主要原因。研究人员认为对这些 CAR-T 细胞群的鉴定和表征为与抗癌反应和白血病长期缓解相关的 CAR-T 细胞特征提供了新的见解[2]。
使用 CyTOF 跨多个时间点分析 CD3+ CAR+ T 细胞
PD-1 抗体与 CAR-T 细胞联用效果分析（IF=22.11）
尽管许多患者经过 CAR-T 疗法后疾病获得缓解，但只有 30-40% 的大B细胞淋巴瘤患者和约 60% 的滤泡性淋巴瘤患者取得长期缓解。在 CAR-T 细胞治疗失败的患者中，肿瘤细胞或肿瘤微环境的免疫检查抑制点蛋白（PD-L1、LAG3）的基线表达水平更高。研究人员观察到临床上一些 CAR-T 细胞治疗后进展的淋巴瘤患者，在使用免疫检查点抑制剂时，可以产生疗效反应。
因此，宾夕法尼亚大学医学院研究人员提出了使用 PD-1 抗体可以逆转 CAR-T 细胞治疗后 T 细胞耗竭的假说，开展了一项帕博利珠单抗用于 CD19 CAR-T 治疗后复发/难治性B细胞淋巴瘤患者的临床试验。为了评估治疗过程中与临床疗效潜在相关的生物标志物，研究人员使用 CyTOF 分析了基线和 CAR-T 细胞扩增峰值时 PBMC 中 CAR-T 细胞的比例、CAR-T 细胞和非 CAR-T 细胞的不同分化特征以及有临床疗效和没有疗效患者的 CAR-T 细胞和非 CAR-T 细胞的特征，结果表明 CAR-T 细胞输注后使用帕博利珠单抗是安全的且耐受良好，并在一部分患者中产生了临床疗效。有疗效的患者在帕博利珠单抗给药后，CAR-T 细胞活化和增殖增加，并且耗竭程度较低[3]。
有临床疗效和没有疗效患者CAR-T细胞特征的比较
尽管 CAR-T 已经展现出了治疗实力，奠定了其突破性地位，但现有的 CAR-T 治疗中出现了很多问题。很多患者出现了细胞因子风暴、神经毒性、过敏等不良反应；有的患者使用 CAR-T 治疗后很快就复发；还有的甚至对 CAR-T 治疗没有反应。
CyTOF 技术是一种高通量单细胞蛋白质分析技术，利用金属元素作为抗体的标签，以质谱作为检测手段，可同时分析单细胞表面和内部的 50 多种标志物，可对患者体内 CAR-T 细胞表型和功能进行深入而细致的分析，探索产生不良反应、治疗复发以及治疗无效的原因，监测免疫细胞动态，从而实现靶向治疗。
【参考文献】
[1] Weber EW, Parker KR, Sotillo E, et al. Transient restrestores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling.Science. 2021
[2] Melenhorst JJ, Chen GM, Wang M, et al.Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells. Nature.2022
[3]Chong EA, Alanio C,Svoboda J, et al. Pembrolizumab for B-cell lymphomas relapsing after orrefractory to CD19-directed CAR T-cell therapy. Blood. 2021
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