引物设计:这些条件记得遵守

1.常用的引物设计软件：Primer 5，软件有很多，选择看个人。

Primer 5界面

2. 引物长度（primer length）一般在15~30碱基之间，常用的是18-25 bp。 

3.引物GC含量在40%~60%之间，GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。正反向引物的GC含量不能相差太大。

4. 引物3′端最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 

5. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

6.引物形成引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 

7. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。

8. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。 

9. 引物应具有特异性。 引物设计完成以后，可进行进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

10.用作克隆目的的PCR，只需要能扩增到相应产物即可，引物设计如有问题可退而求其次，尽量去满足条件。用于定量实验的引物要求更高，扩增片段必须具有特异性，引物不能有任何的错配、引物二聚体和非特异性扩增的存在。