hello，大家好，这一篇我们要看一下单核转录组和空间转录组的联合分析，参考文章在Transcriptomic Profiling Reveals Cancer-Associated Fibroblasts as Potential Targets for the Prognosis and Treatment of Cervical Squamous Cell Carcinoma，其实最主要的目的就是在于了解单核转录组与空间转录组的联合分析及运用。
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ABSTRACT
为了了解宫颈鳞状细胞癌 (CSCC) 的病因、结构和免疫学特征，对来自 20 个人的宫颈样本进行了单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 和空间转录组学 (ST) 实验。在探索影响 CSCC 个体内免疫异质性的可能因素时，确定了一组在某些肿瘤周围富集的癌症相关成纤维细胞 (CAF)，它们高度表达 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。结果表明，CAFs可能通过抑制淋巴细胞浸润和重塑肿瘤细胞外基质来支持肿瘤的生长和转移。此外，高 CAF 信号预测 CSCC 患者的临床结果较差。数据还揭示了 HPV 在肿瘤中的感染情况、参与宫颈癌病变进展的关键因素以及肿瘤代谢与免疫反应强度之间的关联。总的来说，研究结果可能会改善 CSCC 的预后和治疗方法。
INTRODUCTION
Cervical cancer is the fourth most common cancer affecting women’s health globally, especially in low- and middle-income regions. Since 2018, the World Health Organization (WHO) has called for the global elimination of cervical cancer, quantifying actions in vaccination, screening, and disease treatment/management，which require joint efforts from different parties for decades（这一段大家了解即可）.
Currently, over 12 types of human papillomaviruses (HPVs) are carcinogenic 。 其中，HPV16占宫颈癌病例的60%-70%，尤其是宫颈鳞状细胞癌（CSCC）。 HPV 编码三种癌蛋白，包括 E5、E6 和 E7，它们可以破坏细胞周期并导致不受控制的细胞分裂。 CSCC的发展一般要经历低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL）和浸润性宫颈癌，这可能需要几十年的时间。 CSCC 的肿瘤微环境 (TME) 是由病毒、癌细胞、基质细胞和免疫细胞之间复杂的相互作用形成的，但由于技术限制和缺乏研究，尚未完全表征。 破译推动疾病进展的因素可能会产生新的预后和干预策略。
早期宫颈癌行根治性子宫切除术虽然可以获得良好的预后，但晚期宫颈癌的5年总生存率或无病生存率均不尽如人意。目前，化疗（如紫杉醇、顺铂、贝伐珠单抗等）和放疗仍是转移或复发患者的主要姑息治疗策略，反应率低（48%），生存期短（17个月）.免疫疗法通过逆转疲惫或受抑制的免疫活动，为治疗无法治愈的宫颈癌带来新希望。针对程序性细胞死亡 1 (PD1)、程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1) 和细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4 (CTLA4) 的免疫检查点阻断 (ICB) 药物目前正在试验中用于治疗复发性/转移性宫颈癌。不幸的是，ICB 治疗的总体反应率很低，从 4% 到 26% 不等。阐明 CSCC 的免疫状况，尤其是 TME 中的免疫抑制状态，可能有助于我们更好地解决这一现象并调整我们对宫颈癌的治疗策略。
单细胞测序和空间转录组学 (ST) 是揭示肿瘤细胞异质性和微环境的最先进工具，但此类技术在 CSCC 研究中的应用仍然很少。 在这项研究中，收集了 20 个人的宫颈样本，并结合单核 RNA 测序 (snRNA-seq) 和 ST 来研究病因、结构 和 CSCC 的免疫学特征。 破译 HPV 诱导的 CSCC 的转录组变化将为 CSCC 的诊断、预后和治疗提供新的见解。
RESULTS
snRNA-seq data revealed the cellular composition of CSCC
为了充分表征宫颈组织的细胞组成，收集了 5 名患者的 CSCC 样本进行 snRNA-seq。共有67,003个细胞和30,996个基因通过质控，根据经典细胞标志物从中鉴定出14种细胞类型，包括癌细胞（6,960）、柱状上皮细胞（CECs，22,396）、内皮细胞（6,340）、平滑肌细胞(4,502)、成纤维细胞 (9,836)、B 细胞 (689)、单核细胞 (5,281)、T 细胞 (4,930)、调节性 T (Treg) 细胞 (1,081)、浆细胞 (3,236)、髓样树突细胞 (DC) (955 )、浆细胞样 DC (272)、肥大细胞 (384) 和自然杀伤 (NK) 细胞 (141)。子宫颈包含两种类型的细胞在其表面排列，子宫颈外层为复层鳞状上皮细胞，子宫颈内膜和隐窝上有简单的柱状上皮细胞。鳞状上皮细胞的发育不良导致 CSCC。因此，癌细胞主要表达已知的CSCC相关基因SERPINB3（Serpin Family B Member 3），鳞状细胞的肿瘤基因TP63、CDKN2A和角蛋白基因KRT15。由于组织主要来自晚期癌症患者（FIGO IB2-IIIC1期；在化疗前宫颈活检期间收集没有分期信息的组织），因此很少分离出正常的上皮鳞状细胞。 snRNA-seq counts与高风险 HPV 参考基因组的映射揭示了癌细胞中病毒基因的存在。还鉴定了一大群柱状上皮细胞，它们高度表达 MUC5B 和 WFDC2。这种细胞类型主要位于子宫颈内皮上皮，但也可以出现在成人子宫颈和一些腺体的鳞柱交界处。平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞是构成宫颈间质的主要细胞类型。平滑肌细胞高表达MYH11、MYLK、ACTG2、COL3A1和COL1A1，成纤维细胞除COL3A1和COL1A1外还高表达LAMA2，而内皮细胞可通过EMCN、FLT1和EGFLT的高表达来区分。除了子宫颈的结构细胞外，还鉴定了多种免疫细胞类型，其中单核细胞（ITGAX、MX4A7）、T细胞（CD3E、CD247）和浆细胞（MZB1、IGKC）最为丰富。简而言之，snRNA-seq 数据提供了一个全面的图谱，显示了 CSCC 组织的结构和免疫细胞组成（细胞marker注意搜集一下）。
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Spatial transcriptomic characterization of CSCC
空间信息对于理解组织中的细胞间相互作用至关重要，不幸的是，这在 snRNA-seq 数据中被忽略了。因此，利用 SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq) 技术来获取原位基因表达谱。获得了来自 2 名非癌症患者和 14 名 CSCC 患者的宫颈样本，并将其嵌入 OCT。从每个 OCT 块中解剖出 10 μm 厚的连续冷冻切片，用于立体测序、苏木精和伊红 (HE) 染色以及免疫组织化学 (IHC) 染色。最后，共成功获得 18 张 ST 载玻片（非癌，n=3；CSCC，n=15）。 Stereo-seq 芯片中的捕获点直径为 220 nm，两个相邻点之间的中心距为 500 nm。捕获spot被分组到箱中以包含足够的基因以进行准确的聚类。初步分析显示，肿瘤区域的 RNA 丰度比基质区域高得多。为了平衡肿瘤和基质之间的表达差异，在 bin（100 x 100 点）处对 CSCC ST 载玻片进行了注释，以充分展示组织成分，其覆盖面积约为 49.72 x 49.72 μm。 CSCC ST 载玻片的每个 bin 的平均基因数介于 1,767 到 4,152 之间。由于来自非癌症患者的三张 ST 载玻片的基因表达强度低于 CSCC 载玻片，因此它们在 bin200 (99.72 x 99.72 μm) 处进行了注释。统一流形近似和投影 (UMAP) 分析表明，CSCC 和非癌症的 bin cluster倾向于彼此分离，而 CSCC 的 bin cluster则显示出一些收敛。
考虑到癌组织的复杂结构，根据专业病理评估（基于HE和IHC染色结果）和标记基因表达模式手动进行了ST载玻片的初始注释。在分析的 CSCC 样本中，通常鉴定出六种类型的组织cluster，包括肿瘤、间质（无明显炎症）、炎症（间质具有弥漫性炎症或局灶性炎症）、腺体、血管和坏死。肿瘤、基质和炎症cluster广泛分布在 CSCC 样本的 ST 载玻片中，某些样本包含坏死、腺体和血管。根据基因表达谱，组织cluster可以进一步分为带有数字后缀的subcluster。应该记住，ST cluster实际上是一个定义区域内的小区的混合物，但由其主要特征指定。例如，肿瘤cluster不完全由癌细胞组成，也可能包含其他细胞类型，但数量很少，如免疫细胞、成纤维细胞等。组织特异性基因也显示出空间模式。 KRT5、CDKN2A、SERPINB3等癌性鳞状细胞相关基因主要富集在ST肿瘤区，IGKC和IGLC2主要富集在炎症区，VIM在间质区，ADRA2A在血管中，MUC5B在腺体中富集。一般而言，在 ST 肿瘤区域中观察到的转录和翻译活性、细胞增殖、氧化磷酸化和免疫反应高于其他区域。 ST 载玻片的初始手动注释用于辅助 TME 的下游分析。
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关于HPV的病因学作用，病毒基因在宫颈组织中的表达一直是人们感兴趣的话题。 将 ST 测序读数与 HPV 参考基因组作图，发现捐献 15 个样本的所有 14 名 CSCC 患者均为 HPV 阳性，其中 85.7%（12/14）被 HPV16 感染，7.1%（1/14）被 HPV33 感染，并且 HPV58 为 7.1% (1/14)。 HPV 读数覆盖了病毒基因组的 8% - 100%（约 600 bp - 7905 bp），主要在 ST 肿瘤区域被识别。 空间可视化展示了同一样本不同肿瘤部位病毒基因的不同捕获信号，包括 E5、E6、E7、和 L1 经常观察到。 In contrast, only marginal HPV reads were identified in the non-CSCC samples 。
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ST data resolved the evolutionary trajectory of CSCC（空间进化轨迹）
由于 ST 数据能够揭示同一组织切片内不同肿瘤区域的空间分布，这为研究 CSCC 的进化轨迹提供了机会。高级别上皮内瘤变、原位癌和浸润癌代表宫颈的不同病理状态，它们经常同时发生在同一患者身上。然而，由于技术限制，同一个人内这些病理过程的动态变化仍然模糊不清。在这里，首先通过计算其 CytoTRACE 评分（关于CytoTRACE，大家可以参考我的文章10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace，非常棒的方法）来评估 ST 载玻片中每个肿瘤亚群的分化状态。同时使用 HE 染色来识别宫颈上皮及其相邻肿瘤区域。癌性上皮区被认为是浸润前癌病灶，而邻近肿瘤区域的CytoTRACE评分相对较高，表明分化程度相对较低，被认为是浸润性癌病灶。由于远离上皮的肿瘤的转移路径难以确定，因此该分析不包括此类肿瘤区域。最后，确定了来自独立患者的两个样本（TJH37 和 TJH90），其中包含侵袭前和侵袭性病变。cluster 14 和 16 被识别为侵袭前病变，而cluster 12 和 13 分别被确定为 TJH37 和 TJH90 的侵袭性病变。
基于侵袭前病变与侵袭性病变（Log 2FC > 0.5 或 Log 2FC < -0.5，P < 0.001）的差异表达基因（DEGs）的功能分析表明，上调基因主要参与皮肤发育、角质形成细胞分化、 对伤口和细菌的反应、维生素 D 受体 (VDR) 通路、血管发育和中性粒细胞脱颗粒，主要与分化和对有害刺激（如 HPV 感染、上皮损伤）的反应增强有关。 相比之下，下调的基因与 RNA 代谢、氧化磷酸化、线粒体组织、细胞呼吸和病毒 mRNA 翻译显著相关，表明侵袭性癌症病变中的代谢增加。 VDR 通路在侵袭前病变中的积极参与值得注意，这表明其在宫颈粘膜免疫中的重要作用。
然后，试图查明参与癌性病变进展的关键基因。两个样品共有 16 个 DEG（Log2FC > 1.0 或 Log2FC < -1.0，P < 0.001）。伪时间分析表明，12个基因（ANXA1、AL136982.6、CRCT1、S100A7、S100A9、SPRR1A、SPRR1B、SPRR2A、SPRR2D、SPRR2E、KRTDAP和KRT17）被其他浸润前癌病变基因过表达（而CD74、MT2A、KRT5 和 KRT15) 往往被侵袭性病变过度表达。由于早期预后对于宫颈上皮内瘤变 (CIN) 患者的分类至关重要，我们很好奇这些 DEG 是否具有任何临床价值。我们从基因表达综合（GEO）数据库中下载了 GSE63514 数据集，其中包含 66 个宫颈浸润前（CIN）和 38 个浸润性病变（宫颈癌）样本，并进行 PCA 分析以验证 DEG 的区分能力。结果表明，11个DEGs的组合（其余5个基因在该数据集中未鉴定）可以很好地区分浸润前（CIN）和浸润性病变（宫颈癌）。随机森林 (RF) 测试显示这 11 个基因（ANXA1、S100A9、S100A7、KRT15、SPRR1A、SPRR1B、CD74、KRTDAP、MT2A、CRCT1 和 KRT5）具有相似的重要性。 RF 分类模型也表现出良好的性能，在 10 次测试中达到了 0.848 的平均 AUC（ROC 曲线下面积）。总之，这些 DEG 可能为 CIN 和癌症之间的鉴别诊断提供新的见解。
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Variable immune inhibition in CSCC（免疫抑制）
关于 ICB 治疗宫颈癌的低反应率，决定仔细检查 CSCC 的免疫状况以寻找线索。在 snRNA-seq 和 ST 数据中评估了具有不同免疫功能的三个基因组的表达谱，即共刺激、细胞毒性/效应子和共抑制/耗竭。在单细胞水平上，共刺激基因在先天免疫和适应性免疫细胞中均有表达，尤其是在 Treg、T 和 NK 细胞中。发现 Treg 细胞高度表达 CD27、CD28、CD40LG、ICOS、TNFRSF18、TNFRSF4 和 TNFRSF9。虽然这些基因是 Treg 细胞成熟和正常抑制功能所必需的，但 Treg 细胞中 CD27 的过度表达可能会抑制抗肿瘤免疫反应。在空间上，共刺激基因倾向于在肿瘤和炎症区域富集。特别是，TNFRSF18（也称为糖皮质激素诱导的TNF受体，GITR）在炎症和肿瘤区域中普遍表达。然而，其在非癌症样本的上皮细胞中的表达也上调。在snRNA-seq 数据中，该基因主要在 Treg、NK、T 细胞和肥大细胞中检测到。虽然TNFRSF18与肿瘤中Treg细胞的免疫抑制有关，但其高空间表达水平可能是由多种类型的免疫细胞共同贡献的。免疫细胞毒/效应基因主要由 T 和 NK 细胞表达，其中一些在 ST 载玻片的炎症和肿瘤区域通常上调，包括 GNLY、GZMA、GZMB 和 NKG7。这些基因主要由 NK 细胞表达，表明 NK 细胞在针对 CSCC 的细胞毒性反应中起着不可或缺的作用。对于共抑制/耗竭基因，我们未能在我们的 ST 数据中检测到 CTLA4 和 PD-1 的任何显著表达，尽管 Treg 细胞可以高度表达 CTLA4，Treg、T 和 NK 细胞可以高度表达 PD-1。 PD-L1 主要由浆细胞样 DCs 表达，仅在一小部分 ST 样本的肿瘤或炎症区域过度表达。虽然 CD276、ENTPD1、IDO1、LGALS9 和 VSIR 通常在 ST 样本中检测到，但与非癌症样本相比，只有 IDO1 和 LGALS9 在 CSCC 样本中似乎具有更高和更广泛的表达。这两个基因都由 DC 表达，并且可以下调细胞毒性 T 细胞的活性。 IDO1 和 LGALS9 是否可以成为比 CTLA4 和 PD-L1 更好的 ICB 治疗 CSCC 的靶点仍有待探索。此外，当我们放大检查同一ST载玻片中的免疫基因时，它们的表达在不同肿瘤区域之间可能会有很大差异。在样本 TJH08 中，肿瘤通常表达高 IDO1、低 PD-L1 和非常低的 CTLA4。相比之下，样本 TJH37 中只有一个肿瘤区域表达这些基因。总的来说，尽管我们的 snRNA-seq 和 ST 数据都显示了 CSCC 患者免疫衰竭的证据，但患者之间和患者内部的免疫微环境差异很大。
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Hypermetabolic tumors were associated with low immune response
代谢可以调节肿瘤的免疫微环境，这可能是癌症治疗的推定干预目标。分别对六个途径进行了基因集变异分析 (GSVA)，包括缺氧、乳酸、糖酵解、脂质代谢、磷酸戊糖和氧化磷酸化途径。然后将上述六种途径的 GSVA 评分的平均值计算为每个肿瘤区域的代谢评分。根据 GSVA 代谢评分，排名前 20 位的 ST 肿瘤cluster被归类为高代谢肿瘤，而那些排名最后 20 位的为低代谢肿瘤。一般来说，高代谢肿瘤在氧化磷酸化、糖酵解和乳酸途径中表现出更高的活性，表明增殖的癌细胞中存在活跃的有氧糖酵解，即 Warburg 效应。此外，高代谢肿瘤还伴随着严重的缺氧和活跃的脂质代谢，表明快速生长的肿瘤存在强烈的氧化和营养应激。进一步观察到代谢和免疫反应之间的负相关。发现高代谢肿瘤经历了较低水平的适应性和先天免疫干扰、淋巴细胞浸润和淋巴管生成。根据每个 bin（100 x 100 个点）中的基因模块表达评分进一步探讨了肿瘤分化、缺氧和免疫之间的关系。较低的肿瘤分化水平（由较高的 CytoTRACE 评分表示）与较严重的缺氧呈正相关（r = 0.28，P < 0.001）。此外，缺氧与适应性免疫呈负相关（r = -0.19，P < 0.001），尤其是淋巴细胞浸润（r = -0.22，P < 0.001）。值得注意的是，Th1细胞（r = -0.17，P < 0.001）、B细胞（r = 0.30，P < 0.001）、未成熟B细胞（r = -0.18，P < 0.001）和肥大细胞（r = -0.22, P < 0.001) 在缺氧肿瘤中显著降低。虽然缺氧对先天免疫评分没有显著影响，但在缺氧的肿瘤中发现 CD56-NK 细胞增加（r = 0.27，P < 0.001）和未成熟的树突状细胞（r = 0.23，P < 0.001），这可能无法有效对抗癌细胞。进一步尝试分别使用 TOP2A 和 PTPRC 作为增殖细胞和免疫细胞的标志物在空间上验证代谢和免疫之间的相关性。在样本 TJH34 和 TJH35 中，能够在同一 ST 载玻片中识别高代谢和低代谢肿瘤区域。在低代谢肿瘤区域内外检测到更高的 PTPRC 表达，与 HE 图像中的淋巴细胞分布模式一致。这些观察结果表明，由活跃增殖的肿瘤引起的氧气和营养缺乏环境可能会阻止 B 细胞、肥大细胞以及功能性 DC、NK 细胞和辅助 T 细胞的积累。总的来说，分化差的肿瘤往往代谢更活跃，这可能导致缺氧和缺乏免疫干预。
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Identification of a cluster of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in CSCC
在探索样本 TJH34 中高代谢和低代谢肿瘤区域之间的免疫差异时，注意到高代谢肿瘤区域外有一个独特的空间cluster。这个cluster不同于大多数间质cluster，看起来像一条包裹着肿瘤的丝带。分析认为这个特定的cluster可能对塑造肿瘤区域之间的免疫异质性至关重要。由于该cluster是基质的一部分，仔细检查了 snRNA-seq 数据中的成纤维细胞。幸运的是，鉴定了来自所有五个样本的一小组成纤维细胞，它们高度表达了 CAF 的报告标记基因，包括 ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP。 CAFs 的干细胞评分低于癌细胞和成纤维细胞，并且处于不同的细胞周期阶段。基于标志基因集（MSigDB v7.4，https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）的功能富集表明CAF与成纤维细胞和癌细胞具有共同的活动。 CAF 参与成纤维细胞的类似途径，包括紫外线反应减弱、血管生成、肌生成和上皮-间质转化。对于包括 p53 通路、KRAS 信号转导、雌激素反应、有丝分裂纺锤体、G2/M 检查点和 E2F 目标在内的通路，CAF 显示出与癌细胞相似的活性。在基因水平，CAFs不仅高表达成纤维细胞的标志基因，如胶原蛋白家族（COL1A1、COL3A1、COL4A1、COL5A2、COL6A3等），还高表达恶性鳞状细胞的标志基因，如KRT4和KRT13角蛋白家族的。尽管癌症中的 CAFs 可能有不同的起源，但上皮特征表明 CSCC 样本中 CAFs 的起源可能与 EMT 相关。
为了定位 CSCC 组织中 CAF 的空间分布，采用了 Moncada 等人开发的多模态交叉分析 (MIA) 方法，整合snRNA-seq和ST数据（关于MIA的方法，大家可以参考我的文章MIA用于单细胞和空间的联合分析）。简而言之，该方法计算了由snRNA-seq数据识别的细胞类型特异性基因与由ST数据表征的区域特异性基因的表达水平的重叠程度。由此产生的 p 值越小，在后面的描述中被称为 MIA 分数，定义的细胞类型和 ST 区域之间的相关性就越强。初始 MIA 结果表明，ST 聚类结果符合相应区域的预期细胞组成。不幸的是，单独的 MIA 分数不能完全反映细胞的空间特异性，尤其是在 RNA 丰度低的区域。因此，同时利用经实验证实与 CAF 相关的 POSTN 的高表达水平和 CAF 的高 MIA 分数来定义 CAF 的 ST cluster。结果表明，CAFs 在 ST 载玻片中的一些肿瘤区域周围富集，包括样本 TJH34 的高代谢肿瘤区域。通过使用相同样本的连续组织切片对 POSTN 进行 IHC 染色，进一步证实了 CSCC 中 CAF 的存在。值得注意的是，并非所有肿瘤区域都被 CAF 包围，这让我们对与这些细胞存在相关的生物学差异感到好奇。
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CAFs might facilitate the growth and metastasis of CSCC from diverse aspects
为了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物学功能，将 ST 载玻片中的肿瘤区域分为两种类型：CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs+肿瘤）和未被 CAFs 包围的肿瘤区域（CAFs-肿瘤）。 发现三张 ST 载玻片包含 CAFs+ 和 CAFs- 肿瘤区域，并用于下游分析。 然后使用这3个样本的CAFs+和CAFs-肿瘤区域之间上调和下调的DEG进行GO富集分析。 结果表明，CAFs+肿瘤在能量使用、代谢、有丝分裂和细胞生长方面比CAFs-肿瘤更活跃。 同时，细胞粘附、凋亡和免疫反应在 CAFs+ 肿瘤中下调。 上述观察结果与 CSCC 的免疫和代谢异质性非常吻合，尤其是在样品 TJH34 中。 这些表明CAFs的存在可以从不同方面支持肿瘤进展。
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接下来，计算了 993 个单个细胞关于免疫基因集的基因模块表达分数，以评估免疫细胞丰度。 结果显示 CAFs+ 肿瘤中 B 细胞、CD4 T 细胞、CD8 T 细胞、中性粒细胞、DC、NK 细胞和 Th1 细胞的数量显著减少。 有趣的是，在 CAFs+ 肿瘤中发现了更多的巨噬细胞，可能是肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)，这可能促进癌细胞的增殖和迁移。 因此，CAFs 不仅可以作为物理屏障阻止促免疫细胞浸润到肿瘤区域，还可以招募抗免疫巨噬细胞以促进肿瘤的生长。
作为基质的一部分，CAF 必须与癌细胞、基质细胞和免疫细胞密切相互作用。事实上，对 snRNA-seq 数据的分析表明，CAF 与其他细胞之间在细胞外基质 (ECM) 形成和细胞-细胞接触方面存在复杂的相互作用。 CAFs 高表达胶原家族基因，特别是 COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL4A2、COL4A5、COL6A1、COL6A2 和 COL6A3）与免疫细胞和平滑肌细胞表达的 CD44 相互作用，可能参与细胞粘附和迁移。胶原蛋白还与由癌细胞、免疫细胞和基质细胞表达的整合素家族的不同成员相互作用。同样，由 CAF 表达的 FN1（纤连蛋白 1，一种可溶性糖蛋白）和层粘连蛋白（LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMC1、LAMC3）也通过整合素与其他细胞类型相互作用。整联蛋白是由 α 和 β 亚基组成的膜受体蛋白，参与细胞粘附和识别。有趣的是，CAF 使用不同的异二聚体形式的整联蛋白来接触其他细胞类型。它们可能通过由α2β1、α3β1和αvβ8亚基组成的整合素与癌细胞相互作用，同时通过由α9β1、α6β1和α1β1亚基组成的整合素与内皮细胞、CEC、平滑肌细胞相互作用，并通过与T细胞和NK细胞相互作用。由亚基 α1β1 组成的整合素。重要的是，CAF 可以利用 F11R（也称为 JAM1，连接粘附分子 1）通过 F11R 和 JAM3 与癌细胞和基质细胞形成紧密连接，这可能会阻止免疫细胞的浸润。 CAF 还可能表达其他基质蛋白，包括 THBS1（血小板反应蛋白 1）、THBS2 和 TNC（生腱蛋白 C），以通过 CD44、整合素（α3β1）和 SDC1 与免疫细胞、平滑肌细胞、癌细胞和浆细胞进行交流。此外，CAF 过度表达了几种组织重塑因子，包括 POSTN（骨膜蛋白，一种分泌的细胞外基质蛋白）、FAP（成纤维细胞活化蛋白，一种丝氨酸蛋白酶）、MMP1（基质金属蛋白酶 1）、TNC（肌腱蛋白-C，一种基质蛋白）、和 LOXL1（赖氨酰氧化酶 1，催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联）。这一证据表明 CAF 在塑造肿瘤细胞外环境中的关键作用。
除了在 ECM 构建中的作用外，CAF 还可以通过过度表达分泌因子（包括 SEMA3C、POSTN、CXCL6）来增强癌细胞的干性和增殖。据报道，SEMA3C 可促进癌症干细胞维持、血管生成和侵袭 36,37。 POSTN 可以通过整合素 αvβ3 激活 Akt/PKB 通路来增加癌细胞的存活率。它还可能通过 PTK7-Wnt/β-Catenin 信号通路促进癌症生长。 CXCL6（C-X-C 基序趋化因子配体 6）虽然主要与免疫反应有关，但据报道可促进食管鳞状细胞癌的生长和转移。 CAF 中另一个高度表达的基因 SNAI2 (Slug) 是一种与蜗牛相关的锌指转录因子，可抑制细胞凋亡并促进癌症进展。 CAF 还表达了几种常见的生长因子，例如 TGFB1（转化生长因子β1）、EGF（表皮生长因子）和 VEGFA（血管内皮生长因子 A）。此外，CAFs 中 LSD1（组蛋白赖氨酸去甲基化酶 1）的上调可能会抑制 IFN 激活以逃避免疫攻击 42。CAFs 产生的 Wnt5a 信号蛋白也可能抑制免疫反应以促进肿瘤转移。总之，CAFs 可能能够增强 TME，促进肿瘤的进展。
The presence of CAFs was associated with poorer outcomes of CSCC patients
为了验证 CAF 的促肿瘤作用，首先使用来自癌症基因组图谱 (TCGA)45 的数据集进行生存分析，其中包含 252 名 CSCC 患者。 使用标记基因组（ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP）计算每位 CSCC 患者的 CAF GSVA 评分。 毫不奇怪，较高的 CAF 信号预测了不利的无进展生存期（HR = 1.66，95%CI = 1.03-2.67，P = 0.038）和总生存期（HR = 1.69，95%CI = 1.00-2.84，P = 0.05） 用于 CSCC 患者。 接下来，测量了 POSTN（一种 CAF 的生物标志物）在 61 个存档的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) CSCC 样本的癌症病变附近的基质中的表达水平。 相关性分析表明，POSTN 表达水平越高，分化越差、肿瘤分期越长、淋巴结转移越频繁、外周血鳞状细胞抗原 (SCC) 浓度越高，这进一步证实了 CAF 的促肿瘤发生能力。
总的来说，分析结果表明 CAFs 是 CSCC TME 的重要组成部分，形成屏障以保护癌细胞免受免疫监视和清除，分泌细胞因子以刺激细胞增殖和血管生成，抑制细胞凋亡，并重塑 ECM 以促进肿瘤转移 . 考虑到 CAFs 的恶化作用，它们可能成为 CSCC 预后和治疗的潜在靶点。
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DISCUSSION
尽管疫苗和根治性子宫切除术是预防和治疗宫颈癌的有效措施，但复发/转移宫颈癌的治疗仍然是实现消除宫颈癌目标的一大障碍。 在此，我们结合 snRNA-seq 和 ST 技术描绘了 CSCC 的高分辨率转录组图谱，详细描述了 CSCC 的病因、结构和免疫学特征，这可能有助于 HPV 诱导的宫颈癌的管理和治疗。
数据显示 HPV 在癌性宫颈鳞状细胞中的转录或翻译活跃，致癌基因（E5、E6 和 E7）高度表达。由于 HPV 具有 DNA 基因组，从转录组数据中恢复几乎完整的病毒基因组是表明晚期肿瘤中病毒活性活跃的生动证据。 HPV 基因组包含两个多聚腺苷酸化位点。早期多聚腺苷酸化 (AE) 位点位于 E5 和 L2 之间，由 E6、E7、E1、E2、E4 和 E5 的转录本共享。晚期多聚腺苷酸化 (AL) 位点位于 L1 开放阅读框之后，L1、L2 甚至 E7 和 E4 的转录本都使用它。由于 Stereo-seq 使用 polyT 捕获 mRNA，因此与聚腺苷酸化位点相邻的基因可能有更高的测序机会，这反映在 E5 和 L1 的普遍高于其他基因的表达上。尽管如此，早期基因，尤其是 E5、E6 和 E7，往往比包括 L1 和 L2 在内的晚期基因具有更高的表达。因为 HPV 在分化的鳞状细胞中组装和释放子代病毒粒子，所以在增殖的癌细胞中早期基因的表达高于晚期基因是合理的。此外，虽然与 A E 位点不相邻，但癌基因 E6 和 E7 在肿瘤中显示出与 E5 相似甚至更高的表达水平，表明它们在宫颈鳞状细胞的肿瘤发生中起关键作用。事实上，针对病毒 E6 和 E7 基因的治疗性疫苗在治疗宫颈癌前病变和癌症方面已显示出一些有希望的结果。
传统的bulk RNA 测序和单细胞 RNA 测序通常不足以获得连续病理状态的基因表达谱。在此，我们使用包含侵袭前和侵袭性癌症病变的组织样本，通过尖端 ST 方法揭示了与发育不良进展相关的关键基因和途径。发现在侵袭前状态上调的 VDR 途径对于维持粘膜屏障稳态和预防微生物感染至关重要。 VDR 通路可以被 Toll 样受体 (TLR) 上调，以诱导抗菌因子，如人体中的导管素。此外，据报道，服用维生素 D 可以改善由结核病感染引起的肺部病变。因此，TLR-VDR 轴可能是对抗 HPV 感染的关键。 TLR 家族的激动剂，如咪唑喹啉和瑞喹莫特，以及维生素 D，可能是治疗癌前病变和癌病变的可能疗法。此外，在我们的测试数据中，侵袭前和侵袭性病变之间的DEG 在区分 CIN 与宫颈癌方面表现出良好的性能。四种上调基因，包括 CD74、MT2A、KRT5 和 KRT15，与几种类型的鳞状细胞癌的肿瘤进展相关，它们在 CSCC 中的预后价值可能值得进一步研究。
如今，ICB 疗法，尤其是那些使用 PD-L1/PD-1 和 CTLA4 抑制剂的疗法，是治疗转移性宫颈癌的新方法之一。几项研究报告了 PD-L1 在宫颈癌中的广泛表达，阳性率从 34% 到 96% 不等。然而，单独的 PD-L1 表达与宫颈癌患者的疾病结果无关 61。事实上，不同试验对 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 抑制剂的反应率波动很大，而且疗效似乎独立于相关检查点基因的表达状态。在我们的研究中，除 LGALS9 和 IDO1 外，CSCC 肿瘤和炎症区域中大多数免疫检查点基因的表达水平并不显著高于非癌样本中的表达水平。 LGALS9（即半乳糖凝集素 9）通过与 T 细胞表面的 Tim-3 结合或抑制 DC 的抗原呈递能力来下调效应 T 细胞免疫。虽然已证明半乳糖凝集素 9 信号通路的破坏可诱导患有胰腺导管腺癌的小鼠的肿瘤消退，但在肺转移小鼠模型中报告了相反的效果。 IDO1 主要在 DC 中表达，有助于将色氨酸降解为犬尿氨酸，从而抑制 T 细胞功能。发现抑制IDO1可以增强HeLa和SiHa肿瘤球细胞的放射敏感性，表明IDO1抑制剂作为放射增敏剂的潜在应用。靶向 LGALS9 和 IDO1 是否可以改善 CSCC 的治疗需要进一步探索。我们的研究还揭示了高氧和高营养压力的肿瘤区域的免疫监视不足，突出了代谢调节在 TME 中的关键作用。事实上，最近的临床试验将检查点抑制剂与针对葡萄糖、氨基酸和核苷酸代谢的代谢药物结合起来。更好地了解免疫反应和新陈代谢之间的串扰将进一步有益于癌症治疗。
CAFs 已在多种类型的癌症中表征，并且可以分为不同的亚型。虽然细胞系研究表明 CAFs 在宫颈癌细胞增殖中的支持作用，但这是第一项系统描述 CSCC 临床样本中促肿瘤 CAFs 的空间分布和生物学特性的研究。由于组织异质性，CAFs 的标记基因因癌症而异。在本研究中，ACTA2、POSTN、ITGB4 和 FAP 是鉴定 CSCC 中 CAF 的足够标记基因。其他基因如 KRT4、ITGA1、COL24A1 和 COL7A1 可能作为 CSCC 中 CAF 的互补标记基因，显示成纤维细胞和癌性鳞状细胞的细胞特性。这些 CAF 对 TME 的异质性做出了显著贡献，TME 通过促进肿瘤生长、转移和免疫逃避而表现出促肿瘤发生表型。 CAFs+肿瘤增殖活跃但缺乏淋巴细胞浸润。将这些免疫逃避的肿瘤暴露于免疫系统对于根除癌细胞至关重要。因此，建议在治疗晚期 CSCC 患者时结合针对 CAF 的疗法。研究人员已尝试使用抗体或抑制剂干扰 CAF 的激活、作用和正常化过程，并正在进行多项临床试验。由于 CAF 高度表达的基因对正常组织也是必不可少的，因此需要密切监测其功效和副作用。
总之，数据系统地证明了 CSCC 中病毒基因表达、免疫反应和代谢的高度异质性，表明针对多个生物学过程的联合药物或疗法将是治疗 CSCC 的更好实践。 除了治疗性疫苗和 ICB 疗法外，我们的研究结果表明，对 CAF 和肿瘤代谢的干预可以补充目前对 CSCC 的治疗。 对这些生物学方面的进一步研究可能有助于开发针对 CSCC 和其他 HPV 诱导的鳞状细胞癌的新药物或疗法。
Methods
Identification of viral RNA
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Analysis of the progression trajectory of cervical cancerous lesions with ST data
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Multimodal intersection analysis (MIA)
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