文献链接：Challenges in neoantigen-directed therapeutics
发表期刊：Cancer cell
影响因子：31.7
发表时间：2023年1月
原文作者在期刊内总结了 “新生抗原靶向治疗” 当下面临的挑战和潜在突破点，尤其生物信息学相关软件汇总很详细~
1. 肿瘤免疫治疗的现状
1.1 免疫检查点抑制剂(ICI)不是万能的
希望ICI单药治疗潜在的所有癌症患者是不现实的。在一些NSCLC患者研究队列中显示纳武利尤单抗对其治疗并没有明显效果。Haslam等人的一项分析估计，符合ICI药物治疗条件的美国癌症患者的比例为43%，而实际上只有12%的患者对该治疗有反应。尽管PD-L1的表达仍被认为是预测ICI治疗反应使用最广泛的生物标志物，但Yarchoan等人进行的一项队列研究显示，在所有主要肿瘤类型的10,000个样本中，只有15.2%的患者患有PDL1阳性肿瘤。
1.2 免疫细胞疗法仍存在局限性
ACT疗法领域中的CAR-T疗法，已经在几种血液肿瘤中表现出显著疗效并获得FDA认可。但是CAR-T疗法在实体瘤中的局限性可能归因于对TAA的选择而非TSA。同时，对于晚期癌症患者免疫系统受到抑制，也是ACT疗法无法在实体瘤患者中发挥重要作用的原因。此外，实体肿瘤表现出非常复杂的免疫抑制回路，这些都有利于肿瘤细胞躲避免疫攻击。这种 肿瘤的异质性 可能是癌症免疫疗法在许多类型癌症中失败的主要原因。
肿瘤特异性抗原（TSA）vs 肿瘤相关抗原（TAA）：TSAs只在肿瘤细胞表达，通常为体细胞突变或肿瘤特异性基因表达或剪切模式。TAAs为在肿瘤细胞中显著富集的特征抗原，不过该类抗原也可能表达在正常的细胞中（但是通常只在肿瘤细胞中高表达）。由于TAA属于自身抗原并不容易激发免疫反应，药物研发中也很少选择此类抗原，避免其脱靶效应会损伤非病理性组织和细胞。
1.3 新生抗原靶向治疗带来希望
肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）与肿瘤特异性突变肽的数量呈现正相关，与患者使用PD-1抑制剂有效反应呈正相关。也是最初推动人们用“新生抗原”控制肿瘤生长的启发点。因此人们开始探索个性化免疫疗法，旨在增加新抗原特异性T细胞数量。其中便包括肿瘤疫苗，或获得性细胞治疗（adoptive cell therapies, ACT）如TCR-T和CAR-T疗法。
2. 联合治疗策略（新抗原驱动疗法）
由于ICI单药治疗在不同癌症类型中的抗肿瘤活性相对较低，人们开始尝试各种联合治疗策略，其中基于新生抗原的免疫疗法被广泛关注。同时，纵向评估治疗方法来揭示某些耐药机制的潜在发展是非常有必要的，有利于临床实验高效调整治疗方法。据观察，在ICI治疗下复发的肿瘤表现出不同于起始的新表位突变谱。
肿瘤的异质性：近年来，人们发现肿瘤免疫微环境对肿瘤进展和免疫治疗反应预测至关重要。一些失败的临床结果在如今可以通过基因和免疫环境异质性来解释。目前3种“免疫类型”被定义，immune inflamed, immune excluded, immune deserted。
2.1 inflamed tumors：新抗原驱动疗法和ICIs
此类肿瘤存在大量免疫细胞浸润，但肿瘤的免疫逃逸使得免疫细胞的活性受到抑制。考虑到新抗原可以作为激活免疫系统抗肿瘤的重要反应靶点，因而将靶向新抗原的治疗与ICI结合可能具有重要的临床价值。肿瘤疫苗可以诱发和增强广泛的新抗原特异性T细胞水平，而ACT疗法原则上可以传递大量的特异性T细胞而不需要体内扩增。无论以上哪种方式的肿瘤新生抗原T细胞，都能在肿瘤微环境中产生IFN-γ，它通常与肿瘤细胞上PD-L1表达上调呈现正相关，从而诱导效应T细胞的非活化状态。多项临床研究表明癌症疫苗和ICI治疗联合存在好处，也有报道指出TIL-ACT方法联合派木单抗有效治疗乳腺癌患者。综上所述，ICI治疗确实能够激活免疫抑制环境中的靶向新抗原的效应T细胞的肿瘤杀伤活性。
2.2 excluded tumors：新抗原驱动疗法和抗血管生成疗法
非免疫浸润型肿瘤通常存在致密的间质结构，这会导致T细胞和其他抗肿瘤的免疫细胞无法浸润。因此，新抗原诱导的T细胞或ICI疗法都无法到达肿瘤部位发挥作用。这种情况下，将两者与抗血管生成疗法结合，针对血管化的方法诱导肿瘤组织的T细胞浸润。不过，截止到目前仍然没有观察到有相关临床III期的有益报道，但是，有多篇研究显示，ICI治疗联合抗血管生成疗法有望重新激活excluded tumor中的耗竭T细胞（尤其在肾细胞中）。
2.3 deserted tumors：新抗原驱动疗法和ICD诱导疗法
deserted tumors患者的免疫治疗方法选择有限，免疫原性细胞死亡疗法（ICD）正是针对此类症状开发的一种疗法。放疗、化疗和溶瘤病毒疗法都可能导致免疫原性细胞死亡，导致不同的分子突然释放，其中便包括癌症抗原，受损的蛋白，受损的分子和促炎性细胞因子，从而激发免疫系统抗击癌细胞。新抗原诱导的免疫疗法同样可以促进ICD的反应，因而与其联合治疗将会使得此类患者更加受益。细胞还原疗法在手术前后都能够缩小肿瘤体积或消除残留的或转移性癌细胞，还被发现可以用作原位疫苗。它可以减少抑制性免疫细胞的数量，同时提高疫苗的效力。最近有临床I/II期研究表明，化疗和治疗性疫苗接种显著延长了宫颈癌患者的生存率。仅使用化疗的OS仅为10-13.3 months，而联合治疗将中值OS提高到16.1 months
图1. 解锁新抗原疗法潜能的因素概述：工作流程大致为 获取肿瘤穿刺样本-->免疫分型-->治疗方法选择-->新抗原疗法设计-->肿瘤状态监控-->肿瘤复发或抗性
3. 新抗原特异性反应鉴定
3.1 外周血的免疫评估
ELISPOT，多重免疫染色，抗原特异性主要组织相容性复合体多聚体现在被广泛用于评估疫苗诱导的T细胞表型、功能和占比（体外或体外刺激后）。IFN-γ ELISPOT可以准确得测量单个疫苗多肽表位特异性T细胞的频率，而激活标志物如 41BB和脱颗粒酶标志物CD107a的表达，可以评估疫苗诱导的T细胞的激活状态和细胞毒性潜力。TCR-seq同样可以评估T细胞克隆型的数量变化。不过，如果要对新抗原特异性T细胞免疫进行全面和深入的分析，往往需要大量的PBMC样本。不过scTCR-seq和scRNA-seq使得研究者在单克隆水平上解析疫苗特异性T细胞反应称为可能。能够在高分辨率水平提供此类细胞的表型和功能信息。
3.2 肿瘤样本的免疫评估
通过外周血了解循环T细胞反应，并且整合肿瘤TILs和其他免疫细胞的状态对疫苗接种后的临床研究非常重要，以此可以评估个性化肿瘤疫苗的效力。肿瘤组织的质量和数量一般都很局限，但是新技术的发展突破了这一限制。对于FFPE样本，可以在空间水平，通过多重免疫组化和免疫荧光方法完整得表征肿瘤免疫浸润特征。通过对配对的肿瘤穿刺样本做scRNA-seq和scTCR-seq，评估疫苗治疗前后肿瘤TILs中TCR克隆型的频率，即可追踪每种克隆型随治疗时间所产生的动态差异。scRNA-seq提供了关于携带单个TCR克隆型的T细胞的细胞状态和功能的信息。并可以将肿瘤细胞、基质细胞、各类免疫细胞分成不同的子集，以疫苗接种前后为参照进行不同子集的对比分析。同时，这些不同细胞群在单细胞分辨率的空间分辨信息可以通过空间转录组的方法生成。
图2. 传统的实验工具和免疫基因组学工具可以用于分析外周血和肿瘤组织中的新抗原和新抗原诱导的免疫反应
4. 生物信息学的挑战
将新抗原从患者的整套肿瘤肽中分离出来不是一个简单的工作，因为要考虑多种因素：如患者的HLA类型，肿瘤细胞的异质性，肽的内在加工特性等考虑在内。
新抗原预测框架（当前标准）
- step1: raw data前处理和HLA分型
- step2: reads比对和变异检出
- step3: MHC结合和呈现的预测
- step4: 新抗原的有限排序和选择
图3. 最佳新抗原预测图解
4.1 HLA分型
目前大多数pipeline集中于MHC I类预测，使用DNA测序数据作为输入文件，尽管MHC II类的预测也很重要，但是关于此类分型的pipeline并没有MHC I类多。同时，在很多软件中，RNA-seq数据也可以被用于HLA-typing，但是与DNA-seq的数据相比准确率偏低。本篇文章中作者举例了非常丰富的软件信息，表1仅截取其中部分。
同时，HLA的等位基因丢失、异常突变和表达减少也会影响新抗原的呈递从而造成肿瘤免疫逃逸。因此，在预测新抗原时，也需要考虑HLA基因的表达水平和突变情况。
表1. HLA分型软件（截取部分表格展示）
4.2 read比对和突变检出
reads比对常用的软件如Burrows-Wheeler 和 STAR（分别用于DNA-seq和RNA-seq），肿瘤突变检出软件种类也非常多，大多聚焦于SNP、insertions、deletions(indels)，其中引起阅读框移动的insertions 和 deletions通常比简单的SNV传递更高和更多的免疫原性表位。但不得忽视的是，一些其他类型的肿瘤变异也会产生新抗原。
4.3 新抗原结合亲和力和呈递预测
肿瘤新抗原通过患者MHC复合物递呈对激活T细胞免疫是至关重要的。现有的递呈预测模型都是以突变蛋白为起始点，通过滑窗剪切的方式获得适配MHC-I的8-11个氨基酸的k-mer peptides。这些肽链被输入到预测模型中，根据机器学习的方法和训练数据集被分类和评估。PickPocket 和 smmpmbec是两款基于线性回归模型工作的软件，它们假设每个AA残基对亲和力的贡献是线性相关的。但是最近又出现了更复杂的神经网络模型，用来模拟肽序列和MHC复合物之间的结合效率，虽然它需要更丰富的数据集做支撑，但是这种模型评估总归比线性回归模型更好。
现在已经有两个主要策略来解决HLA多样性在抗原呈递预测中的影响。
- 第一种策略：“等位基因特异性模型”，它是通过对单一HLA类型的数据集进行训练获得。不过现在仅对HLA类型可以匹配数据集的案例预测表现友好，如果对于训练数据集中没有的HLA类型，如罕见或新的HLA类型，仍然表现不佳。
- 第二种策略：“pan-HLA 模型”，它是由多种HLA类型的数据集训练而成，通常用于跨HLA类型的新抗原结合预测，对一些没有遇到过的HLA类型比较友好。
不过早期的算法大多通过体外肽-MHC 亲和力分析获得的数据进行训练的，并没有考虑一系列潜在的影响多肽递呈的因素。比如多肽/MHC的结合稳定性，多肽的降解速率和胞内加工特性及运输等。由于蛋白酶体降解和TAP介导的转运不足，仍然会导致强的MHC结合物存在较低的递呈效率，最终表现为肽递呈预测假阳性水平的增加。
最近还有体内配体数据，通过pMHC-I免疫共沉淀后用MS分析获得数据。这样一来能够更精确得从整体的水平观察整个抗原肽呈递过程。相关的预测软件有NetMHCpan4, MHCflurry, EPIP, EDGE, MHCnuggets，前两个表现出最高的准确性。
4.4 新抗原优先排序
预测工作流程需考虑的因素：MHC-I结合力，拷贝数状态，HLA等位基因的表达水平，患者携带基因突变的表达情况，蛋白酶体降解，TAP介导的转运因素。
最近，The tumor neoantigen selection alliance 发布了一系列特征和阈值，binding affinity（<34 nM）和基因表达水平（>33 TPM），疏水性和pMHC的稳定性（> 1.4h）同样与新抗原递呈有关。对于免疫原性的评估，免疫原的耐受性和同源性被认为是最关键的参数，因为有研究已经阐明~50%的真正能够引起免疫原性的肿瘤表位通常与低同源性有关。
公开可用pipeline
现有的新抗原预测pipeline汇总如图4。绝大多数的这些软件并不直接分析WES/WGS的rawdata，相反得，它们更多得依赖于用户提供突变列表。同时，大部分的pipeline支持RNA-seq数据的处理，用来寻找与患者高表达基因相关的新抗原。大多数的pipeline也实现了HLA的分型；大多数的pipeline都关注SNV和indels，也有个别软件关注融合突变，可变剪切和内含子保留相关突变也能够在部分pipeline中找到。而且所有的pipeline都实现了MHC-I binding分析
图4. 目前可用的新抗原预测pipeline（垂直）及其关注点（水平）：深蓝色表示相应分析已经直接在pipeline中实现；浅蓝色表示对应分析条目需要用户自己提供结果文件
5. 新抗原预测--注意项
5.1 插入缺失、基因融合、可变剪切突变（计入在内）
寻找肿瘤中的免疫原性新抗原是非常具有挑战性的，不仅要找到完整可靠的突变库，同时还要通过突变库尽可能预测到更多可靠的抗原肽。有研究学者指出，人类的免疫系统是可以自动消灭一些低TMB肿瘤中的新抗原癌细胞，因此一个好的新抗原预测算法是非常必要的。因此仅仅聚焦于SNV是不够的，还应该更多得探索融合基因事件，转座子活性和新的isoforms。肿瘤细胞中蛋白酶体降解相关功能蛋白的改变，可能会产生正常细胞中不会存在的蛋白质降解产物。在血液系统恶性肿瘤中，考虑到免疫球蛋白的多样性和B细胞的高突变性，也可能会增加潜在的新抗原库。
小片段的插入缺失、大片段的插入缺失、结构变异都有丰富的预测软件。基因融合突变被多次报道与癌症关联，解决此类问题的软件也非常多，但是大部分都有较高的假阳性，需要更多其他类型的数据或方法做辅助矫正。可变剪切发生在肿瘤细胞的概率比正常组织细胞高30%，因此此类异常蛋白也应该作为一个新抗原pool。可变剪切可以通过RNA-seq数据检测，相关的软件也有很多。
5.2 非典型突变（更有商机）
除了以上提及的突变驱动的肿瘤发生的情况，一些引起肿瘤细胞异常表达的事件也应该考虑在内。例如起始密码子替代、非典型的阅读框改变、长链非编码RNA变异、5' 非编码区的变异等。值得注意的是，此类非典型突变的蛋白质结构是没有变化的，往往会在不同肿瘤类型患者中出现，因此对于肿瘤新抗原疫苗研发而言是非常有价值的靶标，因为它们具有更强的普适性（个体差异小），更容易商业化高效生产。
非外显子突变预测需要整合测序数据和质谱配体数据集，但是质谱的方法仍然受高表达多肽的影响，MHC递呈多肽的数量预测总会偏低。不过，现在也有一些其他的补救方法出现，如核糖体测序，使我们能够验证非典型基因表达来评估内含子区域的表达，并发现已知基因中的替代开放框。质谱可以用来揭示MHC复合物在体内呈现的肿瘤特异性翻译后修饰和蛋白酶体产生的剪切肽。
5.3 肿瘤进化和瘤内异质性（考虑在内）
筛选具有代表性的新生抗原用于肿瘤疫苗是非常重要的一步。瘤内异质性是肿瘤进化的关键，仅仅对单例肿瘤样本进行测序，以及仅针对一种新抗原的个性化治疗是不够的。因此，有必要对具有代表性的活检样本进行多区域测序，用来评估一个给定的新抗原是否由所有的肿瘤细胞表达。
通常而言，肿瘤的克隆进化通常通过拷贝数变异或VAF（变异等位基因频率）来评估。但是VAF的数据结构又会受到拷贝数变异情况影响，因此很多VAF统计软件的精确性都依赖于CNV检测算法的可靠性。这些数据也可以通过单细胞测序来获得，但是这类数据提供的信息不可避免地存在dropout或区域覆盖率低的问题。
5.4 MHC-II表位（考虑在内）
早期的研究普遍认为CD8+ T通过MHC-I抗原复合物激发机体免疫反应是消灭体内肿瘤的主力军。因为肿瘤组织细胞均表达MHC-I而仅存在少量的抗原呈递细胞会有MHC-II的表达。不过，近期越来越多的研究表明，CD4+ T细胞也存在间接或直接的效应功能，仅仅MHC-I类抗原复合物只能诱导次优的抗肿瘤免疫反应。MHC-II参与调解的代谢通路相关研究验证了这一特点，同时也促使了MHC-II结合肽作为肿瘤疫苗的工艺研究发展。不过，由于MHC-II分子是由高度多态的α链和β链组成的异二聚体糖蛋白，被研究的HLA基因数量远多于MHC-I（6 vs 3）使得它的类型更加多变；同时，MHC-II复合体是一个开口式的凹槽，这使得其绑定的多肽长度和序列组成上具有更大的变化。 (13–25 AA for MHC-II, compared with 8–15 AA for MHC-I)
6. 免疫原性预测
免疫原性预测可以通过体外的方法如ELISPOT评估，体外免疫原性评估是一个重要的工具，因为超过90%的预测新抗原是非免疫原性的。现在虽然有一些新的方法涌现，但是仍然不尽如意。
in silico prediction的相关研究仍然是缺乏的，目前只有很少数量的抗原能够引发免疫反应，我们可以通过优先排序来筛选较为可靠的预测精确的抗原。大多数的预测流程都是将新抗原与自然形态的自体蛋白做对比，他们认为序列上越是不相似，越容易被免疫系统识别。
除了抗原肽的前处理、MHC亲和力预测之外，突变肽的氨基酸序列也是影响pMHC-TCR识别和激发免疫系统的重要因素。有许多研究表明，肽内突变的位置很重要，将这一特征整合到新抗原预测管道中，可以提高免疫原性新抗原候选基因的排名；其他研究也报道了免疫原性肽在TCR相互作用位点富集于疏水AA，以及AA的重量、大小和电荷在建立pMHC-TCR复合物中的重要性。这都表明对pMHC-TCR相互作用建模是可行的。目前也有非常多的软件可以使用，但是除了氨基酸的序列，HLA分型以及TCR序列信息，一个好的算法应该还要包括翻译后多肽的修饰特点，将多肽的结构信息整合入预测管道。现在已经陆续有算法将其引入了，但是他们的数据高度依赖已经阐明的TCR-pMHC复合物，例如通过晶体结构来模拟相互作用。因此，目前仍然缺乏高质量的数据来训练算法，导致目前基于蛋白结构的预测工具性能不佳。但是，嵌入structure-based的预测工具总是优于sequence-trained models。
7. 新抗原的选择
新抗原的优先排序是新抗原发现过程中的最后一步。我们通常会选出数百个高亲和力的新抗原，同时还会将一些抗原子集与T细胞反应来观察免疫原性。同时，也要加入一些在肿瘤组织中突变频率偏低的新抗原（靶向单个显性致癌基因会导致多个耐药克隆的发展，而靶向多个新抗原则可能导致特定表位的突变比例下调，而其他表位持续存在）。必须选择一组具有良好代表性的新抗原，覆盖大多数癌细胞而不是全部，以防止免疫逃逸。
最终的新抗原库的大小是另一个需要解决的关键问题。同时靶向多个表位将导致更广泛和更强的免疫反应，同时限制肿瘤细胞生长。此外，在治疗中，不正确的靶点选择和错误识别的表位，以及新抗原特异性T细胞与非突变型抗原的交叉反应，可能不能正确的引导免疫系统对抗肿瘤。为了权衡这两个因素，通常选择多达20种新抗原用于免疫治疗，最大限度地提高每个患者免疫原性新抗原的真阳性比例。但是最佳的所需新表位数量仍然是未知的。
肿瘤的异质性暗示着我们应该重新考虑临床试验的设计方式：很多临床试验的失败归因于次优的患者挑选和分组。直到最近，只有已经完成了标准护理治疗的患者才可以被纳入研究队列。因为那些有高度晚期疾病的患者往往失去了治疗的选择，将他们纳入研究队列会严重削弱临床实验的努力。
basket trails：选择拥有共同生物标志物的不同肿瘤类型患者用于单一治疗
umbrella trails：根据单一肿瘤类型的分子亚型区分患者，并用匹配的靶向治疗来治疗每个亚组
adaptive platform trails：评估不同的治疗组和共同的对照组（其中可以添加新的实验组或放弃已被验证无效的实验组）
这些新的试验平台可以显著提高效率，并提供一个更有效的方法，因为它们可以根据不同癌症的亚型定制化得对目标进行研究
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